一種提高丙酮酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高丙酮酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙酮酸(pyruvate)是生物代謝的中間產(chǎn)物，處于各代謝途徑的中間環(huán)節(jié)，如:是糖 酵解的終產(chǎn)物;通過(guò)脫氫脫羧反應(yīng)轉(zhuǎn)化為T(mén)CA循環(huán)的起始物質(zhì)乙酰-CoA;在丙酮酸羧化酶作 用下生成TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物草酰乙酸;通過(guò)轉(zhuǎn)氨基作用生成丙氨酸等，同時(shí)也是非常重要 的酮酸之一。由于丙酮酸是多種物質(zhì)的合成前體，目前社會(huì)對(duì)丙酮酸的需求量日益增加，其 廣泛的應(yīng)用于日化，食品，醫(yī)療，農(nóng)業(yè)等行業(yè)。
[0003]丙酮酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法兩大類?；瘜W(xué)合成法主要有 酒石酸法、乳酸乙酷空氣氧化法、經(jīng)基丙酮法、電化學(xué)合成法、乳酸催化氧化法。目前丙酮酸 的生產(chǎn)正在以前的化工合成轉(zhuǎn)向通過(guò)微生物發(fā)酵制備。微生物發(fā)酵法相對(duì)于化工合成有更 多的優(yōu)點(diǎn)，如原料的轉(zhuǎn)化率高，污染小，成本低等優(yōu)點(diǎn)。
[0004]目前，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸作為一種替代性的綠色環(huán)保方法成為了國(guó)內(nèi)外研 究的熱門(mén)。而要通過(guò)微生物發(fā)酵獲得高產(chǎn)丙酮酸，其中最關(guān)鍵是要有一株高產(chǎn)并且高生產(chǎn) 強(qiáng)度的丙酮酸菌株。目前對(duì)高產(chǎn)丙酮酸菌株的改造主要集中在對(duì)代謝途徑中的某些關(guān)鍵酶 進(jìn)行過(guò)表達(dá)和一些旁路途徑進(jìn)行敲出。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種通過(guò)過(guò)表達(dá)線粒體丙酮酸載體蛋白來(lái)增強(qiáng)丙 酮酸發(fā)酵的生產(chǎn)強(qiáng)度和產(chǎn)量的方法。
[0006]本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種提高丙酮酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，所述方法是 在丙酮酸生產(chǎn)菌株中過(guò)表達(dá)線粒體丙酮酸載體蛋白。
[0007] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法，是表達(dá)NCBI上GeneID:852800的線粒體 丙酮酸載體蛋白MPC1。
[0008]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述生產(chǎn)菌株是以缺失了Ura基因的光滑球擬酵母 T.glabrataCCTCCM202019為宿主表達(dá)NCBI上GeneID:852800的MPC1 而得到的。
[0009]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述過(guò)表達(dá)是以酵母表達(dá)質(zhì)粒pY26(購(gòu)自德而寶公 司）為載體。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種丙酮酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度提高的重組菌，所述重組 菌過(guò)表達(dá)線粒體丙酮酸載體蛋白MPC1。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組菌，是以缺失了Ura基因的T.glabrata CCTCCM202019為宿主、酵母表達(dá)質(zhì)粒pY26為載體表達(dá)NCBI上GeneID:852800的MPC1。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組菌的構(gòu)建:將目的片段MPC1經(jīng)過(guò)限制性內(nèi) 切酶EcoRI和XamI雙酶切消化后，并將MPC1克隆到EcoRI/XamI雙酶切消化的表達(dá)質(zhì)粒 pY26中，得到重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pY26-MPCl，將重組質(zhì)粒通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到受體菌 T.glabrataCCTCCM202019(TglT)，在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，得到線粒體丙酮 酸載體蛋白過(guò)量表達(dá)的重組菌Tglf(pY26-MPC1)。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述MPC1基因是以釀酒酵母菌株N85基因組為模板 擴(kuò)增得到的。
[0014] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述酵母表達(dá)質(zhì)粒PY26為大腸桿菌-酵母之間的穿 梭載體，在大腸桿菌中選擇標(biāo)記為amp^而在酵母中選擇標(biāo)記為尿嘧啶缺陷型互補(bǔ)。
[0015]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種利用所述重組菌發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的方法，是將重 組菌活化后接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在30°C，220rpm條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0016]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基（/L):葡萄糖120g，尿素3.86g，MgS〇4 · 7H20 0 · 8g，KH2P〇42g，CH3C00Na3g，微量元素液 10ml，維生素液 10ml，初始pH= 5 · 5;所 述微量元素液:MnCl2 · 4H20 12g，F(xiàn)eS〇4 · 7H20 2g，CaCl2 · 2H20 2g，CuS〇4 · 5H20 0.05g， ZnCl20.5g，用2mol/L的HC1溶解后定容至1L;所述維生素液：生物素0.004g，硫胺素 0.75mg，吡哆醇0.04g，煙酸0.8g，用2mol/L的HC1溶解后定容至1L。
[0017]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述接種的接種量為10%。
[0018] 有益效果：
[0019] 本發(fā)明方法可提高丙酮酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度的；相對(duì)于對(duì)照菌株(Tgir(pY26))，本 發(fā)明構(gòu)建的重組菌株Tglf(pY26-MPCl)的細(xì)胞干重、葡萄糖消耗速率、丙酮酸的產(chǎn)量和丙酮 酸生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了 24.9%、28.2%、91.9%和94.1 %的。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 菌株和質(zhì)粒：光滑球擬酵母（T.glabrataCCTCCM202019，TgU-)其為煙酸、生物 素、硫胺素、鹽酸吡哆醇，尿嘧啶5種營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株（即在T.glabrataCCTCCM202019的基 礎(chǔ)上敲除了Ura基因）。酵母表達(dá)質(zhì)粒pY26為大腸桿菌-酵母之間的穿梭載體，在大腸桿菌中 選擇標(biāo)記為amp"，而在酵母中選擇標(biāo)記為尿嘧啶缺陷型互補(bǔ)。
[0021] 細(xì)胞干重的測(cè)定:取一定量的菌懸液于10mL容量瓶中，加入2mL鹽酸(2mol/L)溶解 懸液中的碳酸鈣，加去離子水定容到10mL，充分混勻，用UV7500型可見(jiàn)光分光光度計(jì)，于 660nm處測(cè)定0D值，利用細(xì)胞干重標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出細(xì)胞干重。
[0022]丙酮酸和葡萄糖的測(cè)定:高效液相色譜(HPLC)。儀器:Agilent1260高效液相色譜 儀（配紫外可見(jiàn)檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和工作站），色譜條件：色譜柱:AminexHPX-87H ionexchangecolumn，流動(dòng)相：5mMH2SO4,流速:0.6mL/min，柱溫：40°C，進(jìn)樣量：10yL，紫外 檢測(cè)器波長(zhǎng)：210nm(檢測(cè)丙酮酸），示差折光檢測(cè)器:檢測(cè)葡萄糖，樣品制備：lmL發(fā)酵液于 12，000rpm下離心5min，上清經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)南♂屘幚砗徒?jīng)0.22yL濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行高效液相色 譜分析。
[0023]培養(yǎng)基:種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30g，植物蛋白胨10g，磷酸二氫鉀1.0g，七水硫 酸鎂〇.5g，固體培養(yǎng)基添加20g瓊脂。115°C滅菌15min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖120g，尿素 3 · 86g，MgS〇4 · 7H20 0 · 8g，KH2P〇42g，CH3⑶ONa3g，微量元素液（過(guò)濾除菌）10ml，維生素液 (過(guò)濾除菌）l〇ml，于115°C下滅菌ISminjOg/L的碳酸|丐(單獨(dú)滅菌)被添加用來(lái)調(diào)節(jié)pH。微 量元素液：MnCl2 · 4H20 12g，F(xiàn)eS〇4 · 7H20 2g，CaCl2 · 2H20 2g，CuS〇4 · 5H20 0.05g，ZnCl2 0.5g，用2mol/L的HC1溶解后定容至1L。維生素液：生物素0.004g，硫胺素0.75mg，吡哆醇 ο. 〇4g，煙酸0.8g，用2mol/L的HC1溶解后定容至1L。
[0024] 實(shí)施例1:釀酒酵母MPC1的擴(kuò)增與表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0025] 以釀酒酵母基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到目的基因MPC1片段，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳 得到約400bp的特異片段，目的基因MPC1經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶EcoRI和XamI雙酶切消化后， 濃縮純化，將MPCUMPC2基因定向克隆到表達(dá)質(zhì)粒pY26中，得到重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pY26-MPC1，將上述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞JM109并涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上 進(jìn)行擴(kuò)增。
[0026]實(shí)施例2:重組菌的構(gòu)建與鑒定
[0027]由于上述重組質(zhì)粒上帶有Ura3基因，將上述重組酵母質(zhì)粒分別電擊轉(zhuǎn)化到受體菌T.glabrata(Ura-)(即缺失了Ura基因的T.glabrataCCTCCM202019)，得到在不加尿嘧啶 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的重組菌TgU_(pY26-MPCl)
[0028] 實(shí)施例3:重組菌與對(duì)照菌對(duì)照發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
[0029] 挑取重組菌TgU-(pY26_MPCl)和含有空質(zhì)粒pY26的T.glabrata(Ura-)的單菌落于 種子培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)18_24h，以10 %的接種量，將上述活化培養(yǎng)好的種子液接種到發(fā)酵 培養(yǎng)基中，在30°C，220rpm條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)果如表1所示，重組菌的細(xì)胞干重、 葡萄糖消耗速率、丙酮酸的產(chǎn)量和丙酮酸生產(chǎn)強(qiáng)度相對(duì)于對(duì)照菌(TglT(pY26))分別提高了 24·9%、28·2%、91·9%和 94.1%。
[0030] 表1重組菌TgU_(pY26-MPCl)與對(duì)照菌TgU_(pY26)的發(fā)酵對(duì)比
[0031]
[0032] 雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種丙酮酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度提高的重組菌，其特征在于，所述重組菌過(guò)表達(dá)線粒體 丙酮酸載體蛋白MPC1。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于，所述重組菌是以缺失了Ura基因的光滑 球擬酵母T.glabrataCCTCCM202019為宿主表達(dá)NCBI上GeneID:85280(^^]MPC1。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于，所述過(guò)表達(dá)是以酵母表達(dá)質(zhì)粒pY26為載 體。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于，所述重組菌的構(gòu)建:將目的片段MPC1經(jīng) 過(guò)限制性內(nèi)切酶EcoRI和XamI雙酶切消化后，并將MPC1定向克隆到表達(dá)質(zhì)粒ρΥ26中，得到 重組酵母表達(dá)質(zhì)粒PY26-MPC1，將重組質(zhì)粒通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型 受體菌中，在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，得到線粒體丙酮酸載體蛋白過(guò)量表達(dá)的重 組菌TgU-(pY26-MPCl)。5. -種提高丙酮酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，其特征在于，所述方法是在丙酮酸生產(chǎn)菌 株中過(guò)表達(dá)線粒體丙酮酸載體蛋白。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法是表達(dá)NCBI上GeneID: 852800的 線粒體丙酮酸載體蛋白MPC1。7. 權(quán)利要求1-4任一所述重組菌在發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸方面的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是將重組菌活化后接種至發(fā)酵培 養(yǎng)基，在30°C，220rpm條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基1L中含有:葡萄糖120g，尿 素3·86g，MgS〇4·7H20 0·8g，KH2P〇42g，CH3C00Na3g，微量元素液 10ml，維生素液 10ml，初始pH = 5.5;所述微量元素液:MnCl2 · 4H20 12g，F(xiàn)eS〇4 · 7H20 2g，CaCl2 · 2H20 2g，CuS〇4 · 5H20 0.05g，ZnCl2〇.5g，用2mol/L的HC1溶解后定容至1L;所述維生素液:生物素0.004g，硫胺素 0.75mg，吡哆醇0.04g，煙酸0.8g，用2mol/L的HC1溶解后定容至1L。10. 權(quán)利要求1-4任一所述重組菌生產(chǎn)的丙酮酸在日化、食品、制備藥物、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng) 用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種提高丙酮酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)在光滑球擬酵母菌株中過(guò)表達(dá)線粒體丙酮酸載體蛋白，加強(qiáng)丙酮酸進(jìn)入線粒體，進(jìn)一步加強(qiáng)菌體的生長(zhǎng)，從而提高生長(zhǎng)偶聯(lián)型產(chǎn)物丙酮酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度，通過(guò)基因工程技術(shù)，將來(lái)源于釀酒酵母的MPC1基因過(guò)了表達(dá)于TgU-中，獲得了一株高產(chǎn)丙酮酸的工程菌株TgU-(pY26-MPC1)，相對(duì)于對(duì)照菌株TgU-(pY26)，工程菌TgU-(pY26-MPC1)的細(xì)胞干重、葡萄糖消耗速率、丙酮酸的產(chǎn)量和丙酮酸生產(chǎn)強(qiáng)度相對(duì)于對(duì)照菌(TgU-(pY26))分別提高了24.9％、28.2％、91.9％和94.1％。
【IPC分類】C12R1/88, C12N1/19, C12P7/40
【公開(kāi)號(hào)】CN105462868
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510907318
【發(fā)明人】周景文, 陳堅(jiān), 羅正山, 堵國(guó)成, 劉松, 方芳
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年4月6日
【申請(qǐng)日】2015年12月10日