一種制造苜蓿根瘤菌劑的方法、由該方法制得的菌劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明涉及一種高穩(wěn)定性的苜蓿根 瘤菌劑及其制造方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 根瘤菌能與豆科植物形成共生固氮體已是一個(gè)不爭(zhēng)的話題，但什么樣的根瘤菌能 與豆科植物形成共生體則隨著根瘤菌范圍的擴(kuò)大及根瘤菌多樣性的增加而變得日益復(fù)雜。 豆科牧草能與根瘤菌共生固氮，只有土壤中存在某一豆科牧草所專有的細(xì)菌并達(dá)一定數(shù)量 時(shí)，這種根瘤才能形成。這種能使豆科牧草根上形成根瘤的細(xì)菌，稱為根瘤菌。根瘤菌能從 空氣中固定游離的氮，轉(zhuǎn)變成豆科牧草便于吸收利用的含氮化合物，供豆科牧草生長(zhǎng)之需。 對(duì)于豆科牧草來說，與根瘤菌的共生固氮作用，是增加草產(chǎn)量、節(jié)省氮肥用量的有利特性。 而根瘤菌的有無與多少、固氮率的高低，會(huì)直接影響草產(chǎn)量的多少。因此在未種植過相應(yīng)種 類的豆科牧草的地區(qū)，接種根瘤菌與否是種植豆科牧草成功的關(guān)鍵。即使是種植過豆科牧 草的地區(qū)，接種高效的根瘤菌種，也是增加草產(chǎn)量的有效措施。因此，在播種前對(duì)豆科牧草 種子進(jìn)行根瘤菌接種，能提高牧草產(chǎn)量和品質(zhì)。
[0003] 目前我國(guó)農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中每年施用的化肥氮量已達(dá)2400多萬噸，占我國(guó)化肥養(yǎng)分施 用總量的60%左右，占世界氮肥總施用量的30%左右，居世界之首。施用氮肥對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)生 產(chǎn)的發(fā)展起到了十分重要的作用。但是，近年來我國(guó)氮肥施用的增產(chǎn)效果趨于降低，而環(huán) 境污染則趨于加重，引起了國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。
[0004] 在缺氮土壤中，接種根瘤菌的豆科植物其氮素營(yíng)養(yǎng)約有2/3來自共生固氮，僅有1/ 3是從土壤中吸收來的。豆科植物如果接種適合的根瘤菌，每個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)每公頃可固氮 150kg~200kg甚至更多，接種根瘤菌除能改善豆科植物本身的生長(zhǎng)外，還可以為與其共生 的非豆科植物提供氮素營(yíng)養(yǎng)，因此豆科植物接種根瘤菌可以減少氮肥的大量使用，既能減 少化學(xué)氮肥用量，又能減輕大量使用化學(xué)氮肥所造成的土壤結(jié)構(gòu)破壞和地下水污染。因此， 豆科植物接種根瘤菌對(duì)減少氮肥的投入成本，提高肥料利用率，改善植物生長(zhǎng)具有重要意 義，也是防止水土流失，改善生態(tài)環(huán)境的一個(gè)重要措施。
[0005] 近十年來，我國(guó)豆科植物接種根瘤菌的面積并沒有進(jìn)一步增加。據(jù)估計(jì)，接種根瘤 菌的僅占豆科植物總播種面積的2~3%，與國(guó)外30~50%的接種率相比差距很大，其主要 原因是我國(guó)生產(chǎn)的根瘤菌劑質(zhì)量不高。在美國(guó)有80%的紫花苜蓿在種植前需要進(jìn)行根瘤菌 接種。接種根瘤菌能提早紫花苜蓿結(jié)瘤、提高紫花苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)，還能起到增加土壤有 機(jī)質(zhì)含量，改良土壤結(jié)構(gòu)和提高土壤肥力等作用。國(guó)內(nèi)根瘤菌劑的應(yīng)用效果均表明，接種根 瘤菌劑能使紫花苜蓿干草產(chǎn)量提高37 %以上，結(jié)瘤量提高70 %。
[0006] 根瘤菌的特異性很強(qiáng)，不同種族具有專一性。某一族的根瘤菌只能對(duì)本族的幾個(gè) 豆科屬、種有效，并可以相互接種，而對(duì)不同族的豆科植物則表現(xiàn)無效。如苜蓿根瘤菌對(duì)三 葉草則不起作用，不能形成根瘤。因此對(duì)于不同種豆科牧草需選用其專有的根瘤菌接種才 能發(fā)揮作用。根據(jù)牧草和根瘤菌的特異性關(guān)系，可將根瘤菌分為3類：
[0007] (1)高度特異型：必須要專性根瘤菌接種，這些根瘤菌包括三葉草族、菜豆族、大 豆族等，分別只侵染本屬植物或其屬內(nèi)的若干種。
[0008] (2)特異型：必須用專性根瘤菌接種，但這些根瘤菌不但可侵染本屬，而且可以接 種于近緣屬種，這類根瘤菌包括苜蓿族、豌豆族、羽扇豆族等，如苜蓿族可接種于苜蓿屬 (Medicago)、草木樨屬(Melilotus)和胡盧巴屬（Trigonellea)。豌豆族可接種于豌豆屬 (卩1811111)、巢菜屬(>；[(^3)、山黧豆屬(]^11：1171'118)和兵豆屬(1^118)。羽扇豆族可接種于羽扇豆 屬(Lupinus)和烏足豆屬(Ornithopus)。
[0009] (3)非特異型：其根瘤菌能侵染的植物屬種很多。如豇豆族可接種于豇豆屬 (Vigan)、胡枝子屬(Lenspedeza)、花生屬(Arachis)、木蘭屬（Indigofera)等 10多個(gè)屬。
[0010] 與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)方案及工藝流程可以參見圖1。現(xiàn)有技術(shù)方案可 以大致分為如下三種方案。
[0011] ( - )方案一
[0012] (1)培養(yǎng)基的成分
[0013]甘露醇l〇g或甘油5mL+鹿糖5g，K2HP〇4〇·5g，MgS〇4〇·2g，NaC10·lg，酵母膏l(xiāng)g，〇&0)30.28,0.5%硼酸溶液411^，0.5%鉬酸鈉41^，瓊脂18~2(^，？!1值為7~7.2.壓力滅菌 30s，培養(yǎng)溫度28~30°C。
[0014] (2)搖瓶培養(yǎng)
[0015] 每升培養(yǎng)基加水500mL，在28~30°C溫度條件下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為20轉(zhuǎn)/分鐘。菌種按 10%的接種量接種并培養(yǎng)在種子罐中，通氣0.4~0.8k·m-3 ·S-1，攪拌速度120~200轉(zhuǎn)， 接種24h后，每隔12h取樣檢查菌數(shù)增加情況，菌數(shù)可達(dá)20~30億/mL。
[0016] (3)發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0017] 將種子罐內(nèi)培養(yǎng)好的菌種接入到發(fā)酵罐中，接種量10%~20%，菌數(shù)20億/mL.混 拌吸附將草炭干燥，粉碎過篩.滅菌溫度下降到40°C，混拌.菌液:草炭=1/3:4，拌入0.05 % 鉬酸銨，攪拌后含水30 %以上。
[0018] (4)產(chǎn)品
[0019] 合格根瘤菌劑細(xì)胞>1.4億，雜菌<10%，有效期在5°C以下，工廠儲(chǔ)存6個(gè)月，銷售 到戶時(shí)6個(gè)月內(nèi)菌數(shù)達(dá)到1億以上.
[0020] (二)方案二
[0021] (1)培養(yǎng)基如下
[0022] "標(biāo)準(zhǔn)79"培養(yǎng)基:普通糖10克（加入甘油約2毫升），K2HP〇4 0.5克，MgS〇4 · 7H200.1 克，食鹽0.1克，CS〇4〇.2克，酵母片10片，冷開水1000毫升。
[0023] (2)操作
[0024] 1.菌種:取得菌種斜面，移植到上述培養(yǎng)基的試管斜面上，保溫培養(yǎng)。一切按無菌 操作進(jìn)行，種子菌必須純凈。轉(zhuǎn)移接種時(shí)最好多刮一些移到新斜面試管。新長(zhǎng)起來的菌管斜 面，轉(zhuǎn)移新斜面就比較容易生長(zhǎng)，但一般3~5天后才能逐漸看到白色，平滑，邊緣齊整，突起 的菌苔。
[0025] 2.培養(yǎng):將上述培養(yǎng)液注入小口玻璃瓶中，大約1/4滿。其大小以約一立升為好。用 棉花或多層紗布塞滿瓶頸和瓶口并用兩層紙包扎瓶口，按規(guī)定操作高壓滅菌半小時(shí)。最好 在滅菌后趁溫度下降到不燙手時(shí)即搶溫接種，保溫時(shí)可把瓶斜臥放以便菌面多接觸空氣。 接種后1-3天應(yīng)當(dāng)將瓶振蕩得頻繁一些，每天3-5次，每次數(shù)分鐘，以利好氣性的根瘤菌生 長(zhǎng)，不利嫌氣性的雜菌生長(zhǎng)。如果開始1-2天即呈現(xiàn)混濁，有時(shí)還有氣泡發(fā)生，有酸臭，是雜 菌占了上風(fēng)，培養(yǎng)失敗了，應(yīng)當(dāng)廢棄。如果培養(yǎng)3-5天后液體逐漸由澄倩而混濁這是正常現(xiàn) 象，再堅(jiān)持人工振搖幾天即可移放低溫處備用。
[0026](三)方案三
[0027]目前，國(guó)內(nèi)外大都利用自動(dòng)化發(fā)酵技術(shù)來獲得制備根瘤菌劑所需的高密度細(xì)胞培 養(yǎng)液。大致流程為：菌種的斜面活化-一級(jí)種子液培養(yǎng)-二級(jí)種子液培養(yǎng)-發(fā)酵罐內(nèi)擴(kuò)大 培養(yǎng)-高密度菌劑的獲得。在此期間，發(fā)酵培養(yǎng)基種類繁多，有較為常用的以甘露醇-酵母 粉為主的YMA培養(yǎng)基，以豆芽汁為主要成分的BSE培養(yǎng)基，成分較為簡(jiǎn)單的YA、TY培養(yǎng)基，較 為復(fù)雜的AMM、SM培養(yǎng)基，近期諸如以糖廢料為底物的一些新型培養(yǎng)基也時(shí)有報(bào)道，具體采 用何種培養(yǎng)基，還需根據(jù)不同菌體的生化特性而定。發(fā)酵條件通常為:通氣〇 . 4~0.8kg· m3 ·s-S攪拌速度120~200r·π?η-S溫度28~30°C，接種量1%~10%，種子液的裝液量 20%~60%。放罐時(shí)間則根據(jù)各種類型根瘤菌的生長(zhǎng)狀況而定，經(jīng)過相應(yīng)時(shí)間的培養(yǎng)，菌數(shù) 大都超過 1010CFU·ml/1。
[0028]現(xiàn)有技術(shù)工藝流程所制得的苜蓿根瘤菌劑主要有如下缺點(diǎn)。首先，菌劑含菌數(shù)量 低，是當(dāng)前尤其是我國(guó)根瘤菌劑生產(chǎn)中存在的一個(gè)突出問題。我國(guó)豆科牧草菌根瘤菌劑每 克含菌數(shù)僅3-5億個(gè)(快生型菌劑5億個(gè)/克左右，慢生型菌劑1-3億個(gè)/克）。本發(fā)明人認(rèn)為， 為進(jìn)一步提高菌劑含菌數(shù)，一方面要深入研究發(fā)酵工藝，提高每毫升菌液的含菌數(shù)量;另一 方面要改進(jìn)草炭（目前草炭細(xì)度僅80-100目）的粉碎技術(shù)，以增加草炭對(duì)菌液的吸附量，從 而提高菌劑的含菌數(shù)。第二個(gè)問題是菌劑長(zhǎng)途運(yùn)輸，不但會(huì)對(duì)菌劑質(zhì)量造成影響，例如我國(guó) 幅員遼闊，西北、西南一些省區(qū)有時(shí)甚至還不能在播種前收到菌劑。第三個(gè)問題是用手工方 法進(jìn)行丸衣化接種，工效太低，不能適應(yīng)大面積飛播的需要;如果能夠采用包裹種子丸衣的 設(shè)備，牧草種子接種根瘤菌后再裹上殺蟲藥及各種肥料，經(jīng)風(fēng)干后丸衣種子從丸衣機(jī)出來， 即可用于飛播。另外，目前不僅需要進(jìn)一步提高菌劑質(zhì)量，增加產(chǎn)量和改善菌劑供應(yīng)工作， 而且還需要進(jìn)一步加強(qiáng)菌劑應(yīng)用技術(shù)推廣工作。盡管如此，由于我國(guó)根瘤菌劑產(chǎn)業(yè)起始階 段發(fā)酵水平低、保質(zhì)期短和技術(shù)不成熟、質(zhì)量不過關(guān)等問題，使根瘤菌劑的產(chǎn)業(yè)化和大面積 推廣應(yīng)用受限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0029]本發(fā)明要解決的是常規(guī)苜蓿根瘤菌存在的如下一個(gè)或者多個(gè)技術(shù)問題：（1)根瘤 菌固氮效率低；（2)根瘤菌不適合于工業(yè)化生產(chǎn)加工；（3)菌劑產(chǎn)品穩(wěn)定性差；（4)菌劑產(chǎn)品 有效性低；（5)菌劑產(chǎn)品保質(zhì)期短。
[0030]為了解決上述一個(gè)或者多個(gè)技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種制造苜蓿根瘤菌劑的方 法以及由該方法制得的苜蓿根瘤菌劑和該菌劑在種植豆科植物中的應(yīng)用。
[0031]本發(fā)明的一方面提供了一種制造苜蓿根瘤菌劑的方法，所述方法包括如下步驟：
[0032] S1:獲得苜蓿根瘤菌的菌液；
[0033] S2:獲得包含高嶺土粉末和膨潤(rùn)土粉末的粉劑，所述高嶺土粉末和所述膨潤(rùn)土粉 末的粒度20微米至100微米；
[0034] S3:將所述菌液與所述粉劑混合、干燥并粉碎，從而獲得所述粉劑吸附有苜蓿根瘤 菌的所述菌劑