一種微生物基因改造方法、用于生產(chǎn)高級(jí)脂肪醇、高級(jí)脂肪烴的基因工程菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種微生物基因改造方法、用于 生產(chǎn)高級(jí)脂肪醇、高級(jí)脂肪烴的基因工程菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)今世界能源問(wèn)題成為世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展的瓶頸，利用生物質(zhì)等可再生資源進(jìn)行物質(zhì) 的生產(chǎn)成為當(dāng)今科學(xué)研究的熱點(diǎn)。
[0003] 高級(jí)脂肪醇不僅是高效的生物柴油，而且在醫(yī)學(xué)和日化用品中也有重要的用途。 隨著石油資源的枯竭，脂肪醇的生物法生產(chǎn)受到越來(lái)越多的關(guān)注。長(zhǎng)鏈的烷類和烯類是最 具前景的生物燃料。其物理性狀熔點(diǎn)較低，在生物燃料中最適于用作能源物質(zhì)。因此發(fā)酵 法生產(chǎn)的高級(jí)脂肪醇和高級(jí)烴類將是一種綠色平臺(tái)化學(xué)品。綜合已有文獻(xiàn)來(lái)看，菌種研究 方面，比較有應(yīng)用前景的包括能夠積累高級(jí)脂肪醇和高級(jí)烴類的藻類、用于表面活性劑生 產(chǎn)的假單胞菌、遺傳和操作背景都很清楚的大腸桿菌等。其中大腸桿菌的培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，菌 種本身有高級(jí)脂肪醇和高級(jí)烴類代謝途徑，具有代謝靈活性，易于基因工程改造。對(duì)大腸桿 菌高級(jí)脂肪醇和高級(jí)烴類代謝的研究表明，在以葡萄糖為底物的高級(jí)烴的發(fā)酵中，高級(jí)脂 肪醇和高級(jí)烴類生成過(guò)程如下：（1)通過(guò)糖酵解形成乙酰-CoA; (2)乙酰-CoA進(jìn)入脂肪酸 合成路徑形成脂酰-ACP(3)脂酰-ACP經(jīng)由脂肪酸形成脂酰-CoA; (4)脂酰-CoA被還原為 脂肪醇或經(jīng)由脂肪醛還原為高烷類或烯類。
[0004]目前國(guó)內(nèi)外對(duì)大腸桿菌生產(chǎn)高級(jí)脂肪醇和高級(jí)烴類的代謝網(wǎng)絡(luò)途徑改造有以下 兩種：1、過(guò)量表達(dá)內(nèi)源的TesA'（硫酯酶I，ThioesteraseI)和FadD(脂酰-CoA合成酶， fattyacyl-CoAsynthetase),與此同時(shí)過(guò)量表達(dá)異源的FAR(脂酰-CoA還原酶，fatty acyl-CoAreductase)。這種改造的出發(fā)點(diǎn)是將脂肪酸合成路徑的中間產(chǎn)物脂酰-ACP經(jīng) 由脂酰-CoA轉(zhuǎn)化為脂肪醇。2、過(guò)量表達(dá)內(nèi)源的TesA'和FadD，與此同時(shí)過(guò)量表達(dá)異源的 Acyl-ACP還原酶和脂肪醛還原酶。以上改造的出發(fā)點(diǎn)是將脂肪酸合成路徑的中間產(chǎn)物脂 酰-ACP經(jīng)由脂酰-CoA、脂肪醛轉(zhuǎn)化為烷類和烯類。這兩種改造方法的缺陷是產(chǎn)物烴類的合 成都要經(jīng)由脂肪酸和脂酰-CoA，由于脂肪酸合成、β氧化都是在胞質(zhì)內(nèi)完成的，且脂肪酸 的積累對(duì)細(xì)胞毒性較大，不會(huì)高濃度積累，這限制了這類途徑可能達(dá)到的最高產(chǎn)量。此外， 脂酰-CoA極易被TesA和TesB(硫酯酶II，ThioesteraseII)酯解為脂肪酸，這樣便阻斷 了其進(jìn)一步還原為脂肪醇和脂肪醛進(jìn)而形成烷類和烯類的可能性。因此急需一種具有開發(fā) 潛力的高級(jí)脂肪醇和高級(jí)烴類的合成路徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種微生物基因改造方法用于生產(chǎn)高級(jí)脂肪醇和高級(jí)脂 肪烴。本發(fā)明的目的還在于提供基因工程菌以及使用本發(fā)明的基因工程菌發(fā)酵多種碳源生 產(chǎn)高級(jí)脂肪醇和高級(jí)烴類的方法。
[0006] 本發(fā)明的微生物基因改造方法，包括刪除微生物細(xì)胞內(nèi)由脂酰-ACP生成脂肪酸 的路徑以減少胞質(zhì)內(nèi)自由脂肪酸生成的步驟；其中，所述刪除微生物細(xì)胞內(nèi)由脂酰-ACP生 成脂肪酸的路徑的方法為將微生物中的硫酯酶TesC編碼基因敲除。
[0007] 優(yōu)選地，本發(fā)明所述微生物為大腸桿菌。
[0008] 本發(fā)明的用于生產(chǎn)高級(jí)脂肪醇的基因工程菌，體內(nèi)不含硫酯酶TESC，且含有包含 編碼外源脂酰-CoA還原酶FAR的基因片段的重組質(zhì)粒。
[0009] 上述基因工程菌體內(nèi)的硫酯酶TESC通過(guò)將硫酯酶TESC編碼基因TesC敲除的方 法刪除。
[0010] 本發(fā)明所述包含外源脂酰-CoA還原酶FAR的編碼基因片段的重組質(zhì)粒，優(yōu)選 地，所述重組質(zhì)粒為pTr-FAR，即將外源脂酰-CoA還原酶FAR的編碼基因序列連接于質(zhì)粒 pTrcHisA上。
[0011] 本發(fā)明所述外源脂-CoA還原酶FAR的編碼基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示：

[0014] 本發(fā)明的制備上述用于生產(chǎn)高級(jí)脂肪醇的重組質(zhì)粒的方法，包括以下步驟：
[0015] 1)克隆獲得兩端分別帶有限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)的包含脂 酰-CoA還原酶FAR的編碼基因序列的DNA片段；
[0016] 2)將上述DNA片段與空質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI酶切并連接，獲得 重組質(zhì)粒。
[0017] 上述制備重組質(zhì)粒的方法中，優(yōu)選以海洋桿菌（MarinobacteraquaeoleiVT8) 為模板克隆包含編碼脂酰-CoA還原酶FAR的基因序列的DNA片段，將所述DNA片段和 pTrcHisA質(zhì)粒經(jīng)所述限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI酶切并連接，獲得重組質(zhì)粒pTr-FAR。 優(yōu)選地，所述引物為:FARF:CGGGATCCATGGCAATACAGCAGGTACATCACG,劃線處為BamHI酶切 位點(diǎn):FARR:CGGAATTCTCAGGCAGCTTTTTTGCGCTG劃線處為EcoRI酶切位點(diǎn)。
[0018] 本發(fā)明的用于生產(chǎn)高級(jí)脂肪醇的基因工程菌，為大腸桿菌MGKFPF，其包含上述用 于生產(chǎn)高級(jí)脂肪醇的的重組質(zhì)粒。
[0019] 本發(fā)明的制備上述用于生產(chǎn)高級(jí)脂肪醇的基因工程菌的方法，包括以下步驟：
[0020] 1)將大腸桿菌中的硫酯酶TesC編碼基因敲除，獲得大腸桿菌MGKFM;
[0021] 2)將上述用于生產(chǎn)高級(jí)脂肪醇的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入步驟1)的大腸桿菌MGKFM中，獲得 基因工程菌。
[0022] 本發(fā)明的用于生產(chǎn)高級(jí)脂肪烴的基因工程菌，體內(nèi)不含硫酯酶TESC，且同時(shí)含有 包含編碼外源酰基ACP還原酶PCC7942_orfl594和脂肪醛還原酶PCC7942_orfl593的編碼 基因片段的重組質(zhì)粒。
[0023] 優(yōu)選地，本發(fā)明所述微生物為大腸桿菌。
[0024] 上述基因工程菌體內(nèi)的硫酯酶TESC通過(guò)將硫酯酶TESC編碼基因TesC敲除的方 法刪除。
[0025] 本發(fā)明的用于生產(chǎn)高級(jí)脂肪烴的重組質(zhì)粒，包含?；鵄CP還原酶PCC7942_ orΠ594和脂肪醛還原酶PCC7942_orf1593的編碼基因序列。優(yōu)選地，所述重組質(zhì)粒 為pTr-1593-1594,即將外源的?；鵄CP還原酶（PCC7942_orf1594)和脂肪醛還原酶 (PCC7942_orf1593)的編碼基因片段連接于質(zhì)粒pTrcHisA上。
[0026] 本發(fā)明的制備上述用于生產(chǎn)高級(jí)脂肪烴的重組質(zhì)粒的方法，包括以下步驟：
[0027] 1)克隆獲得兩端分別帶有限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)的、同時(shí)包含 ?；鵄CP還原酶PCC7942_orf1594和脂肪醛還原酶PCC7942_orf1593的編碼基因序列的 DNA片段；
[0028] 2)將上述兩段DNA片段與空質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI酶切并連接， 獲得重組質(zhì)粒。
[0029] 上述制備重組質(zhì)粒的方法中，優(yōu)選以細(xì)長(zhǎng)聚球藻（Synechococcuselongatus PCC7942)基因組為模板克隆獲得兩端帶有不同限制性酶切位點(diǎn)的含有Acyl-ACP還原酶 (PCC7942_orfl594)和脂肪醛還原酶（PCC7942_orfl593)的DNA片段。將所述的DNA片 段和pTrcHisA質(zhì)粒經(jīng)所述限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI酶切并連接，獲得重組質(zhì)粒 pTr-1593-1594。其中優(yōu)選地，所述引物為：1593F:CGGGATCCATGCCGCAGCTTGAAGCCAGC劃線 處為BamHI酶切位點(diǎn)，1594R:CGGAATTCTCAAATTGCCAATGCCAAGGGTTG劃線處為EcoRI酶切 位點(diǎn)。
[0030] 本發(fā)明所述酰基ACP還原酶PCC7942_orfl594的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 2 所示：

[0033] 本發(fā)明所述脂肪醛還原酶PCC7942_orf1593的編碼基因，其核苷酸序列如SEQID No. 3所示：
[0034]
[0035] 本發(fā)明的用于生產(chǎn)高級(jí)脂肪烴的基因工程菌，為大腸桿菌MGKFP34,包含上述用于 生產(chǎn)高級(jí)脂肪烴的的重組質(zhì)粒。
[0036] 本發(fā)明的制備上述用于生產(chǎn)高級(jí)脂肪烴的基因工程菌的方法，包括以下步驟：
[0037] 1)將大腸桿菌中的硫酯酶TesC編碼基因敲除，獲得大腸桿菌MGKFM;
[0038] 2)將上述用于生產(chǎn)高級(jí)脂肪烴的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入步驟1)的大腸桿菌MGKFM中，獲得 基因工程菌。
[0039] 在本發(fā)明的制備基因工程菌的方法中，將大腸桿菌中的硫酯酶TesC編碼基因敲 除的步驟中，包括設(shè)計(jì)帶有TesC上下游同源臂的引物擴(kuò)增catA-sacB的步驟。具體為，設(shè) 計(jì)帶有TesC上下游同源臂的引物擴(kuò)增catA-sacB，其中優(yōu)選的所述引物為：
[0041] 本發(fā)明還提供了上述用于生產(chǎn)高級(jí)脂肪醇的重組質(zhì)粒和基因工程菌在生產(chǎn)高級(jí) 脂肪醇中的應(yīng)用。
[0042] 本發(fā)明還提供了上述用于生產(chǎn)高級(jí)脂肪烴的重組質(zhì)粒和基因工程菌在生產(chǎn)高級(jí) 脂肪烴中的應(yīng)用。
[0043] 上述應(yīng)用具體地為，使用本發(fā)明的基因工程菌發(fā)酵多種碳源生產(chǎn)高級(jí)脂肪醇或高 級(jí)脂肪烴類的方法，所述方法包括在基因工程菌生長(zhǎng)過(guò)程中生物量的積累及加入不同量的 誘導(dǎo)劑時(shí)產(chǎn)物的積累。
[0044] 在上述應(yīng)用中，所述碳源優(yōu)選為甘油，所述誘導(dǎo)劑優(yōu)選的為乳糖。
[0045] 本研究通過(guò)敲除TesC阻斷了脂酰-ACP走向脂肪酸，同時(shí)過(guò)量表達(dá)脂酰-CoA還原 酶FAR，使得細(xì)胞內(nèi)合成脂酰-ACP盡可能多的走向脂肪醇。現(xiàn)有研究不采取這一路徑的主 要原因可能是有以下三個(gè)方面：第一，TesC這一基因的敲除較普通基因難于操作，敲除后 菌株生長(zhǎng)緩慢。第二，負(fù)責(zé)這一步驟的有三個(gè)同工酶操作繁瑣，且定位分工還不足夠明確， 我們的實(shí)驗(yàn)是建立在一系列合成生物學(xué)的軟件和預(yù)測(cè)分析上的。第三，普遍認(rèn)為脂肪酸對(duì) 于細(xì)菌是必需的，因此不會(huì)完全阻斷這里路徑，又不易選擇合適的弱化途徑。
[0046] 本發(fā)明產(chǎn)生如下的技術(shù)效果：
[0047] 本發(fā)明的微生物改造方法、基因工程菌株和質(zhì)粒能夠提高原始大腸桿菌的高級(jí)脂 肪醇和高級(jí)烴類產(chǎn)量，是具有更高高級(jí)脂肪醇和高級(jí)烴類產(chǎn)量的重組基因工程菌。
[0048] 通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)證明，構(gòu)建出來(lái)的基因工程菌相對(duì)于原始菌來(lái)說(shuō)，高級(jí)脂肪醇和高 級(jí)烴類的積累速度和產(chǎn)量都有極大提高。表明這類基因工程菌存在著較大的應(yīng)用潛力。
【附圖說(shuō)明】
[0049] 圖1為本發(fā)明大腸桿菌TESC酶敲除示意圖；其中，H1為TesC基因上游50bp序列， H2為TesC基因下游50bp序列，P1為與CatA-sacB同源的上游引物，P2為與CatA-sacB同 源的上游引物，ybaV為基因組上位于TesC上游的基因，queC為基因組上位于TesC下游的 基因。
[0050] 圖2為本發(fā)明基因工程菌產(chǎn)高級(jí)脂肪醇的代謝途徑。
[0051] 圖3為本發(fā)明基因工程菌產(chǎn)高級(jí)脂肪烴的代謝途徑。
[0052] 圖4為本發(fā)明重組質(zhì)粒pTr-FAR構(gòu)建過(guò)程示意圖。
[0053] 圖5為本發(fā)明重組質(zhì)粒pTr-1593-1594構(gòu)建過(guò)程示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0054] 下述實(shí)施例中所使用的