一種高效表達(dá)人促卵泡激素的cho細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高效表達(dá)人促卵泡激素的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)方法，屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]人促卵泡激素(humanfollicle stimulating hormone，hFSH)是垂體前葉嗜喊性細(xì)胞合成和分泌的一種糖蛋白類促性腺激素，屬于異二聚體糖蛋白家族，由獨(dú)立的基因分別編碼的兩條非共價(jià)連接的α鏈和β鏈組成。FSHa鏈的兩個(gè)潛在的天冬氨酰胺連接的糖基化位點(diǎn)，分別在52和78的位置，而β鏈的兩個(gè)潛在的天冬氨酰胺連接的糖基化位點(diǎn)則分別在7和24的位置(Oli jve ff, de Boer ff ,Mulders JW等(1996)Molecular b1logy andb1chemistry of human recombinant follicle stimulating hormone(Puregon).Mol.Hum.Reprod.2(5): 371-382)。對(duì)于女性來(lái)說(shuō)，其主要功能是卵巢細(xì)胞和雌激素生成必需的一種生長(zhǎng)因子、促分泌劑和細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在促使卵泡正常生長(zhǎng)、成熟和性腺留體類固醇的產(chǎn)生中不可缺少;對(duì)于男性來(lái)說(shuō)，其主要功能是與黃體生成素(LH)控制的睪丸素結(jié)合，從而激活和保持正常精子的數(shù)目和質(zhì)量。
[0003]最初醫(yī)學(xué)使用的促卵泡激素是從絕經(jīng)期婦女的尿液中提純的，1961年Borth第一次將提取的人促卵泡激素用于人體實(shí)驗(yàn)，取得了較好效果。但是這種提純的促卵泡激素內(nèi)有黃體生成素和其它人源蛋白的污染，不僅批次間產(chǎn)品會(huì)出現(xiàn)糖基結(jié)構(gòu)的差異，而且對(duì)尿源的需求量巨大，很難滿足快速增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的重組人促卵泡激素應(yīng)運(yùn)而生，與尿源促卵泡激素(uFSH)相比，rhFSH純度更高，而且沒(méi)有其他人源蛋白污染，批間純度一致性更高。雖然二者在臨床療效上沒(méi)有明顯差另Ij，但rhFSH在提高安全性和降低副反應(yīng)方面更具優(yōu)勢(shì)。
[0004]現(xiàn)已上市的商品化重組FSH都是通過(guò)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovarycell，CH0)基因組中插入人FSH表達(dá)基因而構(gòu)建的永久性表達(dá)細(xì)胞系所生產(chǎn)。最初，重組人FSH都采用含有血清的培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)瓶或者微載體紙片貼壁培養(yǎng)(Recombinant folliclestimulating hormone: development of the first b1technology product for thetreatment of infertility.Recombinant Human FSH Product Development Group.humReprod Update.1998,4(6): 862-881)，由于其中使用動(dòng)物來(lái)源的血清，既不利于純化，也有潛在的動(dòng)物病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)?？墒?，在培養(yǎng)基中不添加血清的話，重組FSH的表達(dá)量將會(huì)顯著降低。近年來(lái)也有關(guān)于大規(guī)模懸浮培養(yǎng)工藝研究的報(bào)道(CH0細(xì)胞表達(dá)rhFSH的大規(guī)模無(wú)血清培養(yǎng)工藝的研究，吉林大學(xué)，2012)，但該工藝種子復(fù)蘇采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，需要轉(zhuǎn)瓶機(jī)，沒(méi)有搖瓶培養(yǎng)方便，而且表達(dá)量也不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種采用含有人FSH基因的重組CHO細(xì)胞來(lái)克服現(xiàn)有的培養(yǎng)方法所致的人FSH表達(dá)量低的問(wèn)題的方法。所采取的技術(shù)方案如下:
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種高效表達(dá)人促卵泡激素的CH0細(xì)胞的培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法是將種子細(xì)胞配制成細(xì)胞懸液，在利用無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，獲得種子懸液，再將所得的種子懸液接種到生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中定期流加無(wú)血清補(bǔ)料培養(yǎng)基，并監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況并補(bǔ)充葡萄糖溶液，培養(yǎng)結(jié)束后收獲細(xì)胞。
[0007]所述培養(yǎng)方法的步驟如下:
[0008]1)將重組CH0細(xì)胞復(fù)蘇活化后，利用無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸后獲得種子細(xì)胞溶液；
[0009]2)利用無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)步驟1)所得的種子細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后獲得細(xì)胞懸液；
[0010]3)將步驟2)所得的細(xì)胞懸液接種到生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中定期流加無(wú)血清補(bǔ)料培養(yǎng)基，控制溫度，檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并補(bǔ)充葡萄糖溶液；
[0011]4)培養(yǎng)結(jié)束后收獲細(xì)胞。
[0012]優(yōu)選地，所述無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基，由濃度為15-20g/L的⑶-CH0培養(yǎng)基、濃度為16?20g/L的CD Opti CH0培養(yǎng)基、濃度為2?5g/L的SFM4CH0培養(yǎng)基、濃度為17-19g/L的CDM4mab培養(yǎng)基或濃度為16_21g/L的Ex-cell 302培養(yǎng)基中的一種或幾種組成;添加物由濃度為0.1?0.3mM的甲硫氨酸、0.2?0.4g/L的碳酸氫鈉、0.5?2g/L的F68、3?5g/L的D-葡萄糖或1?2g/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸中的一種或幾種組成，pH6.8-7.4，滲透壓280-380m0smol.kg—1。
[0013]更優(yōu)選地，所述無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基，是濃度為17?19g/L的CD-CH0培養(yǎng)基、16?18g/L CD Opti CH0培養(yǎng)基或3?4g/L的SFM4CH0培養(yǎng)基中的一種或幾種;添加物為0.15?0.25mM的甲硫氨酸、0.28?0.35g/L的碳酸氫鈉、0.8?1.2g/L的F68或2?4g/L的D-葡萄糖中的一種或幾種4耵.0-7.2，滲透壓300-3601110811101.kg—1。
[0014]優(yōu)選地，所述無(wú)血清補(bǔ)料培養(yǎng)基，由濃度為38?45g/L的FeedB培養(yǎng)基，6?12g/L的Cell Boost 5，10?15g/L CM1027或18?22g/L Feed C培養(yǎng)基中的一種或幾種組成；添加物由濃度10?15g/L的D-葡萄糖，1?3mM的甲硫氨酸，8?10g/L的D-半乳糖或8?10g/L的N-乙酰葡萄糖胺中的一種或者幾種組成，pH6.8-7.4，滲透壓600-1200m0smol.kg—1。
[0015]更優(yōu)選地，所述無(wú)血清補(bǔ)料培養(yǎng)基，由濃度為40?42g/L的FeedB培養(yǎng)基，19?21g/L Feed C培養(yǎng)基或8?10g/L的Cell Boost 5中的一種或者幾種組成;添加物由濃度為1.5?2.5mM的甲硫氨酸或8?10g/L的D-葡萄糖組成，pH7.0-7.2，滲透壓800-1000m0smol.kg-1。
[0016]優(yōu)選地，步驟3)所述生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，條件為轉(zhuǎn)速130-200rpm，溶氧30-80 %，pH6.8-7.4，初始培養(yǎng)溫度為36_38°C ；所述控制溫度，是在培養(yǎng)5_7d后將溫度調(diào)整至32-35°(3;培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞活率為60-100%。
[0017]更優(yōu)選地，所述生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，條件為轉(zhuǎn)速150-180rpm，溶氧40-60%，PH7.0-7.2，初始培養(yǎng)溫度為36.6_37°C ；所述控制溫度，是在培養(yǎng)5_7d后將溫度調(diào)整至33-34°C，培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞活率為80-100 %。
[0018]優(yōu)選地，步驟3)所述定期流加無(wú)血清補(bǔ)充培養(yǎng)基，是在發(fā)酵后第2-9天流加，流加次數(shù)為2-5次，流加比例為8-15%。
[0019]更優(yōu)選地，所述定期流加無(wú)血清補(bǔ)料培養(yǎng)基，是在發(fā)酵后第3-8天流加，流加次數(shù)為3-4次，流加比例為10-12%。
[0020]優(yōu)選地，步驟3)所述補(bǔ)充葡萄糖溶液，是使培養(yǎng)液中葡萄糖濃度在l-8g/L。[0021 ]所述的方法的具體步驟如下:
[0022]1.將低溫保存的重組CHO細(xì)胞取出后在37°C水浴融化后離心留取沉淀，再利用無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，獲得種子細(xì)胞溶液；
[0023]2.利用無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)步驟I)所得的種子細(xì)胞，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速120rpm，溫度37°C，濕度75%，⑶2濃度5%，培養(yǎng)7天經(jīng)過(guò)4級(jí)傳代培養(yǎng)后獲得細(xì)胞懸液；
[0024]步驟I)和步驟2)所用無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基是由18g/L CD-CHO培養(yǎng)基、3.5g/LSFM4CH0培養(yǎng)基、0.2mM的甲硫氨酸、0.3g/L的碳酸氫鈉和1.0g/L的F68組成，pH7.2，滲透壓340m0smol.kg-1 ；
[0025]3.將步驟2)所得的細(xì)胞懸液接種到生物反應(yīng)中進(jìn)行培養(yǎng)，反應(yīng)器體積為3L，接種細(xì)胞密度為5 X 15個(gè)/mL，初始培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速150rpm，溶氧40 %，溫度37°C，pH值7.2，在培養(yǎng)的第4，6和8天分別補(bǔ)充10%的無(wú)血清補(bǔ)充培養(yǎng)基，培養(yǎng)的第7天將溫度調(diào)節(jié)為33°C;培養(yǎng)過(guò)程中檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并補(bǔ)充葡萄糖溶液使培養(yǎng)液中葡萄糖含量不低于lg/mL;所用無(wú)血清補(bǔ)料培