一種靶向apoCⅢ的CRISPR-Cas9系統(tǒng)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，更具體地說涉及CRISPR_Cas9特異性敲除人apoCIII基 因的方法以及用于特異性靶向apoCIII基因的sgRNA。
【背景技術(shù)】
[0002] ，高脂血癥(Hyperlipidemia)是以血漿中膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋 白膽固醇(LDL-C)升高或高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低為表現(xiàn)的一種脂質(zhì)代謝紊亂狀 態(tài)，是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的危險因素之一，可累及全身的很多重要臟器，引起冠心病、腦栓 塞、下肢間歇性跛行等疾病。
[0003] 載脂蛋白CIII(ApolipoproteinCIII，apoCIII)是一種水溶性低分子量(8.8kDa) 蛋白質(zhì)，主要由肝臟合成，是一種分泌型肝蛋白。載脂蛋白CIII是高密度脂蛋白（HDL)和富 甘油三酯（TG)脂蛋白的成分。apoCIII的主要生理功能是抑制脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase，LPL)活性和干擾脂蛋白與細(xì)胞表面葡糖胺聚糖基質(zhì)結(jié)合。已知脂蛋白酯酶(LPL)是 催化富含三酰甘油脂蛋白分解的關(guān)鍵酶。apoCIII能夠阻礙脂蛋白上的apoE與低密度脂蛋 白（LDL)及其相關(guān)蛋白受體的相互作用進(jìn)而減少肝臟對富含三酰甘油脂蛋白的攝取。此外， apoCIII還能夠抑制肝酯酶(HL)的活性。因此，apoCIII的升高導(dǎo)致TG水平升高，進(jìn)而引起諸 如高甘油三酯血癥、心血管疾病等。已有研究發(fā)現(xiàn)，apoCIII基因中外顯子3編碼的N末端肽 段是apoCIII抑制LPL活性的主要部位。目前，已有他汀類藥物、苯氯酸等來調(diào)節(jié)肝臟分泌 apoCIII，高三酰甘油血癥和心血管病患者需長期服用，容易產(chǎn)生耐藥性。靶向apoCIII基因 位點的CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以特異性地降低apoCIII的表達(dá)水平，促進(jìn)富含三酰甘油脂蛋白 的分解，進(jìn)而達(dá)到降低血脂、預(yù)防和/或治療高血脂等心血管疾病的目的。
[0004] CRISPR-Cas9是一種具有核酸內(nèi)切酶活性的復(fù)合體，能夠識別特定的DNA序列，進(jìn) 行特定位點切割從而造成雙鏈DNA斷裂，在沒有模板的條件下，發(fā)生非同源重組末端連接， 造成移碼突變，導(dǎo)致基因敲除。該系統(tǒng)的主要組成部分為:sgRNA序列，負(fù)責(zé)靶向特異性基因 位點;Cas9酶，負(fù)責(zé)對靶向位點的DNA進(jìn)行修飾切割。這一技術(shù)具有更快速、簡便、高效、多位 點、特異性靶向敲除基因的優(yōu)勢。將該技術(shù)應(yīng)用于靶向apoCIII基因的敲除，為實現(xiàn)高脂血 癥和心血管疾病的治療提供了一種可能的選擇。本發(fā)明的目的就是要驗證利用CRISPR-Cas9高效靶向敲除apoCIII基因相應(yīng)的技術(shù)方案，以達(dá)到特異性敲除apoCIII基因的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供靶向apoCIII基因的CRISPR_Cas9系統(tǒng)及其制備方法和用 途。
[0006] 為達(dá)到以上目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] 一種利用CRISPR_Cas9系統(tǒng)在HepG2細(xì)胞中實現(xiàn)apoCIII基因敲除的方法，包括以 下步驟：
[0008] 1、根據(jù)apoCIII基因的序列設(shè)計和選擇用于特異性靶向目的基因的sgRNA;
[0009] 2、在目的基因apoCIII的sgRNA的基礎(chǔ)上設(shè)計sgRNA雙鏈寡聚核苷酸序列；
[0010] 3、將目的基因apoCIII的sgRNA雙鏈寡聚核苷酸序列與線性化的質(zhì)粒載體連接，轉(zhuǎn) 化提取得到目的基因的sgRNA表達(dá)載體；
[0011] 4、構(gòu)建Cas9真核表達(dá)載體；
[0012] 5、轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得apoCIII基因敲除細(xì)胞；
[0013] 6、蛋白質(zhì)印跡法(Westernblotting)檢測apoCIII蛋白的表達(dá)。
[00M]上述技術(shù)方案所述的利用CRISPR_Cas9系統(tǒng)在HepG2細(xì)胞中實現(xiàn)apoCIII基因敲除 的方法，其中，步驟1中，sgRNA在目的基因上的靶序列符合5' -GGN(19)GG或者5' -GN(20)GG 或者21 )GG的序列排序規(guī)則。
[0015] 再進(jìn)一步地，所述步驟！中，sgRNA位于目的基因的3個外顯子（如序列表SEQID Ν0· 1、2和3所示）上。
[0016] 再進(jìn)一步地，所述步驟1中，sgRNA位于目的基因的第2個(如序列表SEQIDN0.2所 示)和第3個外顯子(如序列表SEQIDNO.3所示）。
[0017] 再進(jìn)一步地，所述步驟1中，每條sgRNA的長度為16_22bp。
[0018] 上述技術(shù)方案所述的利用CRISPR_Cas9系統(tǒng)在HepG2細(xì)胞中實現(xiàn)apoCIII基因敲除 的方法，其中，步驟2中，sgRNA雙鏈寡聚核苷酸序列的構(gòu)建過程為：
[0019] ⑴在SgRNA的5'端加上TAAG得到正向寡核苷酸(Forwardoligo);
[0020] (2)再根據(jù)選擇的SgRNA，獲得其對應(yīng)的DNA互補鏈，并在其5'端加上TAGG得到反向 寡核苷酸(Reverseoligo);
[0021] (3)分別合成上述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，將合成的sgRNA寡聚核苷酸的forwardoligo和reverseoligo成對變性、退火，退火之后形成可以連入卩1^_ CRISPR·EFS·GFP載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸，如下：
[0023] 本發(fā)明還提供了特異性靶向apoCIII基因的sgRNA，其序列如序列表SEQIDN0.4-40任意一條序列所示。該sgRNA可以單獨應(yīng)用于apoCIII基因的敲除，也可以多條sgRNA序列 結(jié)合起來應(yīng)用于apoCIII基因的敲除。
[0024] 本發(fā)明還提供了一種能夠在HepG2細(xì)胞中實現(xiàn)apoCIII基因敲除的CRISPR_Cas9系 統(tǒng)在制備用于預(yù)防和/或治療高血脂等心血管疾病的藥物的用途。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點：目前治療高血脂等心血管疾病的小 分子藥物或抗體藥物均需要心血管病患者長期服用，易產(chǎn)生耐藥性。本發(fā)明的CRISPR-Cas9 系統(tǒng)優(yōu)化設(shè)計針對apoCIII基因的3個外顯子的sgRNA，能夠高效抑制apoCIII基因的表達(dá)， 從而降低血脂水平，有助于心血管疾病康復(fù)并有效降低高血脂癥患者的心血管疾病的發(fā)病 率。
【附圖說明】
[0026] 圖 1pL_CRISPR.EFS.GFP質(zhì)粒結(jié)構(gòu)
[0027] 圖2hCAS9質(zhì)粒結(jié)構(gòu)
[0028] 圖3Westernblotting檢測apoCIII蛋白的表達(dá)
【具體實施方式】
[0029] 下面通過【具體實施方式】來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0030] 實施例1
[0031 ]CRISPR_Cas9特異性敲除人apoCIII基因中用于特異性靶向apoCIII基因的sgRNA的設(shè)計和合成
[0032]1.靶向人apoCIII基因的sgRNA的設(shè)計
[0033] (1)在apoCIII基因上選擇S'-GGNd^GG或者S'-GNUOWG或者S'-NUDGG的序 列。
[0034] (2)sgRNA在apoCII I基因上的靶向位點位于基因的外顯子。
[0035] (3)sgRNA在apoCIII基因上的靶向位點位于不同的各種剪切形式的共有外顯子 上。
[0036] (4)在UCSC數(shù)據(jù)庫中用BLAT或NCBI數(shù)據(jù)庫中用BLAST，確定sgRNA的靶序列是否唯 一，減少潛在的脫靶位點。
[0037]根據(jù)以上方法，我們一共設(shè)計了 37個靶向人apoCIII基因的sgRNA，序列分別如序 列表SEQIDN0.4-40所示。
[0038] 2.靶向人apoCIII基因的sgRNA的選擇
[0039] (1)靶向apoCIII基因的sgRNA的靶序列在apoCIII基因上不能離ATG起始子太近， 防止轉(zhuǎn)錄后從下游另一個ATG開始而出現(xiàn)一個被截短的基因形式，不能保證基因完全失活。
[0040] (2)sgRNA在apoCIII基因上的靶向位點位于整個基因的中段。