一種嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶基因及其重組載體及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種嗜熱堿性重組含錳過氧化氫 酶基因及其重組載體和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 過氧化氫酶（Catalase，簡稱CAT)，催化H202分解為Η20和02。各種來源的CAT廣 泛應(yīng)用于食品消毒、醫(yī)學(xué)分析與診斷、紡織、造紙等工業(yè)領(lǐng)域。在紡織染整工藝中CAT主要 用于去除織物漂白廢液中殘余的H202，消除其對(duì)后續(xù)染色工序的影響。與傳統(tǒng)化學(xué)工藝相 比，CAT具有環(huán)境友好、面料后續(xù)印染質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)；但值得注意的是，鑒于紡織印染工藝 的特殊性，CAT的催化反應(yīng)通常需在高溫（T>70°C)堿性（pH>9)環(huán)境中進(jìn)行，這就需要CAT 具備嗜熱嗜堿的應(yīng)用特性。而目前文獻(xiàn)報(bào)道的嗜熱耐堿性CAT仍然較少。
[0003] CAT按蛋白三維晶體構(gòu)象的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為兩類：（1)催化中心含鐵卟啉環(huán)結(jié)構(gòu) 的CAT，稱鐵過氧化氫酶（FeCAT) ; (2)催化中心由錳離子代替鐵離子卟啉結(jié)構(gòu)，稱為錳過氧 化氫酶（MnCAT)。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)個(gè)別來源于高溫堿性環(huán)境中的細(xì)菌可以產(chǎn)生具有嗜 熱嗜堿特性的MnCAT，例如：箱根生金球菌（Metallosphaerahakonensis)來源的MnCAT，在 pH8. 0-10. 0環(huán)境中處理60min酶活損失小于20% ;在70°C下處理50min，酶活殘留率約在 60% ;但目前Metallosphaerahakonensis來源的MnCAT在大腸桿菌中僅有少量的活性表 達(dá)蛋白，且文獻(xiàn)[1]中未表述具體的酶活值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明鑒于上述情況，根據(jù)大腸桿菌密碼子使用偏愛性，對(duì)Metallosphaera hakonensis來源的錳過氧化氫酶基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，提供一種嗜熱堿性重組含錳過 氧化氫酶基因及其表達(dá)載體和重組菌株，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶 的編碼基因，其序列如SEQIDNo. 1所示：

[0008] 所述編碼基因根據(jù)Metallosphaerahakonensis來源的猛過氧化氫酶基因核苷酸 序列，按照大腸桿菌（Escherichiacoli)密碼子使用偏愛性（http://gcua.schoedl.de/seqoverall_v2.html)優(yōu)化設(shè)計(jì)。所述Metallosphaerahakonensis來源的猛過氧化氫酶 基因核苷酸序列選自GenBank數(shù)據(jù)庫。
[0009] 本發(fā)明第二方面提供包含上述重組嗜熱堿性含錳過氧化氫酶基因的重組載體。優(yōu) 選的，所述重組載體使用的表達(dá)載體為PET系列表達(dá)載體。
[0010] 更優(yōu)選的，所述PET系列表達(dá)載體為pET24a(+)，獲得包含上述重組嗜熱堿性含錳 過氧化氫酶基因的重組載體pET24a-MnCat。將本發(fā)明的重組嗜熱堿性含錳過氧化氫酶基因 插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相 連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選將本發(fā)明的重組嗜熱堿性含錳過氧化氫 酶基因插入到質(zhì)粒pET24a(+)上的NdeI和HindIII限制性酶切位點(diǎn)之間，得到重組表達(dá) 載體pET24a-MnCAT，經(jīng)測序驗(yàn)證后保存在大腸桿菌DH5α中。
[0011] 本發(fā)明第三方面提供包含上述嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶基因的重組菌株。
[0012] 所述重組菌株由所述重組含錳過氧化氫酶表達(dá)載體pET24a-MnCAT轉(zhuǎn)化獲得。
[0013] 優(yōu)選的，所述重組菌株由所述重組嗜熱堿性含錳過氧化氫酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿 菌獲得。
[0014] 更優(yōu)選的，所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得的重組菌株為大腸桿菌 BL21 (DE3)/pET24a-MnCAT〇
[0015] 本發(fā)明第四方面提供所述嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶MnCAT，由權(quán)利要求1所 述的嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶基因編碼。
[0016] 本發(fā)明第五方面提供所述嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶的制備方法，包括如下步 驟：
[0017] 1)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
[0018] 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶表達(dá)；
[0019] 3)回收并純化所表達(dá)的嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶。
[0020] 作為優(yōu)選地，上述的重組嗜熱堿性含錳過氧化氫酶的制備方法，包括以下步驟：
[0021] 將所述重組菌株BL21 (DE3) /pET24a-MnCAT在LB培養(yǎng)基中活化過夜后，轉(zhuǎn)接至TB 培養(yǎng)基中，當(dāng)菌濃0D600達(dá)到2時(shí)，添加MnCljPIPTG，再誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得重組嗜熱堿性含錳 過氧化氫酶。
[0022] 所得培養(yǎng)液的菌體破碎上清液中的酶活力可達(dá)300U/mL。
[0023] 進(jìn)一步的，由于載體pET24a(+)上含有6-His純化標(biāo)簽，因此選擇常用的Ni-NTA 樹脂親和層析法進(jìn)行蛋白純化。
[0024] 優(yōu)選的，轉(zhuǎn)接時(shí)按5%轉(zhuǎn)接。
[0025] 優(yōu)選的，轉(zhuǎn)接至含有50μg/mlKan的TB培養(yǎng)基中。
[0026] 優(yōu)選的，所述IPTG的終濃度為0.08mmol/L，所述此(：12的終濃度10mmol/L。優(yōu)選 的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的具體條件為：在37°C條件下誘導(dǎo)24h。
[0027] 本發(fā)明還提供了上述嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶基因的應(yīng)用，尤其是在大腸桿 菌中的高效活性表達(dá)Metallosphaera hakonensis來源的含猛過氧化氫酶的應(yīng)用。
[0028]Metallosphaerahakonensis來源的MnCAT與專利CN103725699A中表述的 Thermusthermophilus來源的MnCAT相比，其蛋白的氨基酸序列具有約5%的差異；氨基酸 序列的差異引起兩種MnCAT三維構(gòu)象的直接變化，從而導(dǎo)致其酶學(xué)性質(zhì)的差異，例如：來源 于Metallosphaerahakonensis的MnCAT的最佳pH范圍為pH8. 0-10.0,在此范圍內(nèi)酶活 力變化平緩，穩(wěn)定性好[1];但來源于Thermusthermophilus的MnCAT的最適pH在pH10. 0， 在pH8. 0-10. 0范圍內(nèi)酶活力呈上升趨勢，無平緩區(qū)間[2]。酶學(xué)性質(zhì)上的明顯差異，表明兩 種來源MnCAT具有其各自的獨(dú)特性。
[0029] 本發(fā)明根據(jù)大腸桿菌密碼子使用偏愛性，對(duì)Metallosphaerahakonensis來源的 錳過氧化氫酶基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，當(dāng)優(yōu)化后的MnCAT在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，搖瓶發(fā) 酵液中最高可檢測到CAT酶活為300U/mL，本發(fā)明通過基因密碼子優(yōu)化及發(fā)酵優(yōu)化實(shí)現(xiàn)了 Metallosphaerahakonensis來源的MnCAT在大腸桿菌中的高效活性表達(dá)，且其發(fā)酵酶活 值達(dá)到約300U/mL，為該酶的進(jìn)一步應(yīng)用開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
[0030] 參考文獻(xiàn)
[0031] [1]Shinji Ebara,Yasushi Shigemori. Alkali-tolerant high-activity catalase from a the