重組人表皮生長(zhǎng)因子的新型制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 該發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域中對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子的克隆表達(dá)，具體包括利用DNA重 組以及發(fā)酵技術(shù)獲得高產(chǎn)量和高活性的重組人表皮生長(zhǎng)因子。
【背景技術(shù)】
[0002] 人表皮生長(zhǎng)因子（EGF)是一種由53個(gè)氨基酸殘基組成的分子量為6kDa的小分子 多肽。廣泛存在于許多組織器官和體液中，可促進(jìn)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，能夠?qū)ζつw起到保 護(hù)作用。其主要是利用其促進(jìn)皮膚組織細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)，使年輕新生的細(xì)胞替代衰老的 細(xì)胞，從而起到抗衰老和護(hù)膚保健等功能。所以，EGF添加于護(hù)膚品中有抗衰老、增加彈性 等功能，對(duì)受損傷的皮膚，能自動(dòng)地進(jìn)行護(hù)理，調(diào)養(yǎng)和修復(fù)。本發(fā)明提供工程菌株RoEGF-1 和用其制備EGF的方法。包括利用大腸桿菌偏愛密碼子合成hEGF基因；構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒 PET27-S-EGF，能夠表達(dá)hEGF與蛋白標(biāo)簽S的融合蛋白；用表達(dá)質(zhì)粒pET27-S-EGF轉(zhuǎn)化宿主 菌并篩選得到工程菌株RoEGF-Ι;將工程菌RoEGF-Ι在大腸桿菌培養(yǎng)基中用IPTG誘導(dǎo)表達(dá) rhEGF。該方法能夠高效穩(wěn)定表達(dá)可溶狀態(tài)的rhEGF蛋白，沒有包涵體沉淀且沒有額外的氨 基酸殘基殘留。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提供了 ：1)經(jīng)過人工改良的更適合于大腸桿菌表達(dá)的人EGF基因序列；2) 利用S標(biāo)簽與傳統(tǒng)表達(dá)載體pET-27b(+)相結(jié)合，提高rhEGF蛋白的產(chǎn)量與活性，克服大腸 桿菌原核表達(dá)所帶來的包涵體不可溶性和不正確折疊引起的低活性等缺點(diǎn)。
[0004] 工程菌株的構(gòu)建： 天然人EGF由53個(gè)氨基酸殘基組成，由159個(gè)堿基對(duì)組成的DNA進(jìn)行編碼。天然的人EGF的DNA序列在編碼的密碼子中有一些密碼子并不是大腸桿菌所偏愛的編碼，因此，基因 序列的改良能夠在一定程度上提高大腸桿菌表達(dá)人EGF蛋白的產(chǎn)量。
[0005] 大腸桿菌表達(dá)蛋白有以下兩個(gè)比較嚴(yán)重的缺陷，1是T7啟動(dòng)子比較強(qiáng)力，誘導(dǎo)表 達(dá)蛋白的速度過快容易形成沒有活性且不可溶的包涵體蛋白；2是由于原核生物體內(nèi)沒有 糖基化系統(tǒng)，且體內(nèi)環(huán)境與真核生物不同，不能有效地正確折疊形成正確的二硫鍵，從而造 成蛋白有時(shí)雖可溶但沒有或者很少有活性。為了克服這幾個(gè)比較嚴(yán)重的缺陷，本發(fā)明在合 成基因的同時(shí)加入了標(biāo)簽蛋白，S標(biāo)簽?zāi)軌蛴行У卦黾拥鞍自诖竽c桿菌中的表達(dá)產(chǎn)量，并且 同時(shí)能夠大幅度地幫助蛋白進(jìn)行正確折疊，而且蛋白經(jīng)過特殊蛋白酶切割后能夠不殘留多 余的氨基酸殘基。在融合蛋白的N端加入Ncol，C端加入BamHI的酶切位點(diǎn)，經(jīng)過優(yōu)化的 DNA序列見圖1與圖2。將該序列與pET-27b(+)均用Ncol與BamHI酶切后進(jìn)行連接并轉(zhuǎn) 化至DH5(i菌種中進(jìn)行擴(kuò)增(具體見圖3)。
[0006] 將擴(kuò)增出的表達(dá)載體質(zhì)粒用化學(xué)轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)化至Rosetta表達(dá)菌株中。利用該 工程菌進(jìn)行蛋白表達(dá)(具體見圖4)。
[0007] 該工藝是在現(xiàn)有的成熟的基因工程技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的改進(jìn)發(fā)明，其中對(duì)于EGF 基因DNA序列的優(yōu)化是現(xiàn)今其他人所沒有的；同時(shí)將標(biāo)簽的高表達(dá)性、輔助折疊特性與PET27載體的可靠性、高表達(dá)性相結(jié)合，表達(dá)出具有活性的EGF蛋白，該技術(shù)產(chǎn)量高活性好， 基本沒有蛋白包涵體沉淀，表達(dá)出的蛋白全部可溶；表達(dá)條件簡(jiǎn)單，僅為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，沒有 過多復(fù)雜的操作步驟與配方，成本低廉。另外，由于蛋白上有His組氨酸標(biāo)簽，所以在分離 純化上十分簡(jiǎn)便，回收蛋白純度95%以上，實(shí)驗(yàn)證明帶有His+S標(biāo)簽的蛋白也具有生物活 性，如果對(duì)蛋白的要求不高可以不去除標(biāo)簽，這樣的純化方式更加簡(jiǎn)潔，如果對(duì)蛋白要求 高，可以采用專用蛋白酶進(jìn)行切割，去掉His+S標(biāo)簽，可以達(dá)到不殘留氨基酸殘基的水平。
[0008] 實(shí)施例1 :pET27b (+) -S-EGF重組載體質(zhì)粒的構(gòu)建 1、按照?qǐng)D1中所示的序列進(jìn)行DNA合成。
[0009] 2、將含有合成的基因(連接在克隆載體上）的細(xì)菌（XLlOgold)穿刺培養(yǎng)物進(jìn)行擴(kuò) 大培養(yǎng)，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取出含有S-EGF的質(zhì)粒(操作按照試劑盒說明書進(jìn)行)。
[0010] 3、對(duì)提取出的質(zhì)粒與pET27b(+)載體分別進(jìn)行酶切。
[0011] 酶切反應(yīng)系統(tǒng)（100μ1)組成為：
將上述兩個(gè)體系分別37度酶切孵育過夜。酶切后使用Qiagen膠回收試劑盒進(jìn)行膠回 收操作，獲得S-EGF片段與線性pET27b(+)載體，測(cè)定濃度后備用。
[0012] 4、將回收的片段與線性載體連接，體系組成（10μ1)為：
上述體系混勻后，16度連接過夜。
[0013] 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中： 取連接產(chǎn)物3μ1加入到一管感受態(tài)菌中，另一管不加任何物質(zhì)作為陰性對(duì)照。冰浴 30min，42°C水浴熱激50sec，快速將其移入冰浴中，放置2min。加入40〇μ1滅菌的LB液體培 養(yǎng)基，37°C搖床中溫和搖動(dòng)lh后將加入連接產(chǎn)物的DH5α涂布于含有卡那霉素的LB固體 培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)12~16h。挑選陽性菌落做DNA抽提，純化出質(zhì)粒DNA，S卩pET27-EGF， 用于轉(zhuǎn)化Rosetta表達(dá)菌宿主。
[0014] 例2 :Rosetta表達(dá)菌宿主的轉(zhuǎn)化 將純化后的PET27-EGF質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至Rosetta中，方法與轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞的 方法相同。
[0015] 例3 :EGF蛋白發(fā)酵表達(dá)與純化 挑取含有表達(dá)載體PET27-EGF的Rosetta單菌落，接種于含有30μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)。次日取上述過夜培養(yǎng)物以1%的比例接種于含卡那霉素的 LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2h，當(dāng)0D600值至0. 2時(shí)，加IPTG至終濃度0. 25mmol/L， 37°C繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)5h。取出培養(yǎng)物于4°C以3000r/min離心20min，收集菌體。重懸Ni-NTA 樹脂，吸取 20ml樹脂于純化柱中，先用LysingBuffer(50mmol/LNaH2P04, 300mmol/L NaCl，10mmol/Limidazole)平衡層析柱。菌體用20mlLysingBuffer重懸并加溶菌酶 至終濃度為lg/L，冰上放置30min，在冰上高強(qiáng)度超聲破碎4次，每次破碎持續(xù)lOsec，每 次破碎間隔lOsec。10000g4°C離心30min，收上清。將上清液加入層析柱中，與Ni-NTA Agarose顆粒4°C孵育lh，用WashingBuffer(50mmol/LNaH2P04,300mmol/LNaCl，20mmol/ Limidazole)洗滌5倍柱床體積以洗去雜蛋白，然后用2倍柱床體積的ElutionBuffer (50mmol/LNaH2P04, 300mmol/LNaCl，250mmol/Limidazole)洗脫蛋白。洗脫蛋白可以用 脫鹽柱或者透析的方法進(jìn)行脫鹽，脫鹽后的蛋白用于切割標(biāo)簽。
[0016] 洗脫后的融合蛋白為S-rhEGF，帶有S標(biāo)簽與6XHis，用標(biāo)簽專用蛋白酶對(duì)融合蛋 白進(jìn)行特異性切割，可以無任何氨基酸殘基殘留(見圖5)。
[0017] 將脫鹽后的融合蛋白加入DTT(至終濃度為2mmol/L)與蛋白酶(帶有6XHisTag)， 蛋白：蛋白酶=10 :l，4°c切割過夜。
[0018] 由于切割下的標(biāo)簽、未被切割的剩余融合蛋白與蛋白酶均帶有6XHisTag，而切 下的EGF蛋白不帶有任何多余氨基酸殘基，因此可利用Ni-NTAAgarose去除切割后的雜 蛋白。將切割產(chǎn)物與Ni-NTAAgarose充分混合后于4°C結(jié)合2h，收集流出的液體，用PBS (pH7. 4)將非特異性吸附的EGF洗脫，收集上清后與之前的流出物合并即為去掉標(biāo)簽的 EGF。蛋白在濾菌并檢測(cè)濃度后即可用于細(xì)胞增殖培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
[0019] 通過SDS-PAGE與WB實(shí)驗(yàn)可以鑒定出EGF有效表達(dá)(見圖6、7)。
[0020] 例4 :蛋白活性檢測(cè)比較 Balb/c3T3細(xì)胞株用完全培養(yǎng)液于37度、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)，控制細(xì)胞濃度為每lml含1. 0X105~5. 0X105個(gè)細(xì)胞，傳代后24~36小時(shí)用于生物學(xué)活性測(cè)定。
[0021] 棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，消化和收集細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液配成每lml含5.0X 104~8.0X104個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100ul，于37度、5%二 氧化碳條件下培養(yǎng)。24小時(shí)后觀察貼壁后換成維持培養(yǎng)液，于37度、5%二氧化碳條件下培 養(yǎng)24小時(shí)。棄去維持液，加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，每孔100ul，于37度、5%二氧化碳 條件下培養(yǎng)64~72小時(shí)。每孔加入10ulCCK-8,置于培養(yǎng)箱中3小時(shí)，用酶標(biāo)儀在450nm處 檢測(cè)吸光值。
[0022] 完全培養(yǎng)液：10%FBS的DMEM 維持培養(yǎng)液：〇. 4%FBS的DMEM 標(biāo)準(zhǔn)品：用維持培養(yǎng)液稀釋至每lml含50IU。在96孔板中做倍數(shù)稀釋，共3個(gè)稀釋度， 每個(gè)濃度做2孔。
[0023] 供試品溶液的制備：將供試品按標(biāo)示量復(fù)溶后，用維持培養(yǎng)液稀釋成每lml約含 50IU。在96孔板中做倍數(shù)稀釋，共3個(gè)稀釋度，每個(gè)濃度做2孔。
[0024] 通過活性檢測(cè)，通過該技術(shù)表達(dá)的融合蛋白有高于國家標(biāo)準(zhǔn)的增殖活性。實(shí)驗(yàn)結(jié) 果見附圖8。
[0025]
【附圖說明】： 圖1合成基因序列，斜體+下劃線為酶切位點(diǎn)；下劃線為優(yōu)化后rhEGF基因序列；未劃 線為標(biāo)簽序列 圖2優(yōu)化后的人EGF基因序列以及翻譯成蛋白質(zhì)的序列。
[0026] 圖3重組人EGF表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。
[0027] 圖4表達(dá)載體表達(dá)蛋白不意圖 圖5蛋白純化切割示意圖 圖6Lane1 :未誘導(dǎo)菌體 Lane2-6 :誘導(dǎo)時(shí)間lh_5h Lane7:Ni-NTA純化后融合蛋白 Lane8 :蛋白酶切割后 Lane9 :去除蛋白酶與標(biāo)簽的EGF蛋白 圖7Lane1-5 :重組人EGF蛋白WB檢測(cè) 圖8重組人EGF蛋白的生物學(xué)活性與標(biāo)準(zhǔn)品活性結(jié)果比較。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 重組人表皮生長(zhǎng)因子的制備方法，包括以下步驟： 用大腸桿菌偏愛的密碼子構(gòu)建和克隆合成的S-hEGF融合蛋白基因； 構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pSE-Ι; 用表達(dá)質(zhì)粒pSE-1轉(zhuǎn)化宿主菌并篩選得到工程菌株RoEGF-1。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中利用大腸桿菌偏愛密碼子編碼的人EGF序列為： 5'AATTCAGATTCTGAATGCCCGCTGTCTCACGACGGTTACTGCCTTCACGATGGTGTTTGCATGTATATCG AAGCTCTGGACAAATACGCGTGCAACTGTGTTGTTGGTTACATCGGTGAACGTTGCCAGTACCGTGATCTGAAATGG TGGGAACTGCGTTAA3,。3. 在Rosetta宿主菌中利用pET-27b(+)載體與His-SUMO標(biāo)簽相結(jié)合用來表達(dá)優(yōu)化后 的人EGF基因的方法。4. 利用該方法生產(chǎn)的重組人EGF蛋白應(yīng)用于化妝品。
【專利摘要】人表皮生長(zhǎng)因子（hEGF）是一種小分子多肽。主要利用其促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)，起到抗衰老和護(hù)膚保健等功能。所以，EGF添加于護(hù)膚品中有抗衰老、增加彈性等功能，對(duì)受損傷的皮膚，能自動(dòng)地進(jìn)行護(hù)理和修復(fù)。本發(fā)明提供工程菌株RoEGF-1和用其制備EGF的方法。包括根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子合成hEGF基因；構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET27-S-EGF，能表達(dá)hEGF與標(biāo)簽S的融合蛋白；用表達(dá)質(zhì)粒pET27-S-EGF轉(zhuǎn)化宿主菌并篩選得到工程菌株RoEGF-1；將工程菌RoEGF-1在培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)rhEGF。該方法能夠高效穩(wěn)定表達(dá)可溶性高活性rhEGF且沒有額外的氨基酸殘基殘留，可用于化妝品的應(yīng)用。
【IPC分類】C07K14/485, C12N15/12, C12N15/70
【公開號(hào)】CN105463006
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410462110
【發(fā)明人】尹成凱
【申請(qǐng)人】尹成凱, 王博
【公開日】2016年4月6日
【申請(qǐng)日】2014年9月12日