Msc促進(jìn)血管新生能力的定量方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及干細(xì)胞領(lǐng)域，具體而言，涉及MSC促進(jìn)血管新生能力的定量方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcells，MSC)是一類源于中胚層的異質(zhì)細(xì)胞群， 可以從人體大多數(shù)組織獲取。它們具有自我更新能力、組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)能力，可以向中 胚層分化，例如:脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，其中，胎盤和臍帶來源的MSC具有分化潛力 大、增殖能力強(qiáng)、免疫原性低、取材方便，沒有道德理論問題的限制、易于工業(yè)化制備等特 征，是最具臨床前景的多功能干細(xì)胞之一。
[0003]血管是人體的重要組成部分，它構(gòu)成了循環(huán)系統(tǒng)的主體。長期以來，對于人自體血 管內(nèi)皮細(xì)胞的各項(xiàng)研究絕大多數(shù)是基于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Humanvascularendothelial cell，HUVEC)。一方面，臍帶來源豐富，容易獲??；另一方面，臍帶血管沒有分支，便于操作， 而且臍帶有著理想的長度，能夠保證細(xì)胞的足夠量。
[0004] MSC的促血管新生的特性對肢體缺血的治療有著非常重要的臨床意義。但是目前 缺乏評價(jià)MSC的促血管新生能力的方法，阻礙了MSC在治療肢體缺血方面的臨床應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明旨在建立一種MSC促進(jìn)血管新生能力的定量方法，對MSC促進(jìn)血管新生能力 進(jìn)行評價(jià)，以指導(dǎo)臨床應(yīng)用，保證MSC的療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的第一技術(shù)方案為一種MSC促進(jìn)血管新生能力的定量方法，其特征在，建立 共培養(yǎng)體系，
[0007]在該共培養(yǎng)體系中共培養(yǎng)MSC和內(nèi)皮細(xì)胞，其中，MSC通過因子分泌的方式來促進(jìn) 內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，
[0008]檢測所述內(nèi)皮細(xì)胞的增殖數(shù)量，
[0009]由所述內(nèi)皮細(xì)胞的增殖數(shù)量，對MSC的促血管新生能力進(jìn)行定量和評價(jià)。
[0010] 第二方案基于第一技術(shù)方案，其特征在于，所述內(nèi)皮細(xì)胞為HUVEC細(xì)胞。
[0011] 第三方案基于第二技術(shù)方案，其特征在于，還檢測VEGF因子，由VEGF因子的數(shù)量對 MSC的促血管新生能力進(jìn)行定量和評價(jià)。
[0012] 第四方案基于第三技術(shù)方案，其特征在于，在建立共培養(yǎng)體系時(shí)，確定孵育時(shí)間、 共培養(yǎng)時(shí)間、MSC和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的比例。
[0013] 第五方案基于第四技術(shù)方案，其特征在于，所述孵育時(shí)間為2h、共培養(yǎng)時(shí)間為72h、 MSC和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的比例為1/10。
[0014]第六技術(shù)方案基于第一至第五中的任一技術(shù)方案，其特征在于，在建立共培養(yǎng)體 系時(shí)，應(yīng)用不同來源的MSC與內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，選擇促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖數(shù)量最少的MSC 細(xì)胞，進(jìn)行移植治療，確認(rèn)其促血管新生能力。
【附圖說明】
[0015] 圖1示出了培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞；
[0016] 圖2示出了CCK8孵育HUVEC細(xì)胞2h后標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0017] 圖3示出了CCK8孵育HUVEC細(xì)胞4h后標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0018] 圖4示出了外源添加VEGF因子量與HUVEC細(xì)胞數(shù)之間標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0019 ] 圖5示出了MSC和HUVEC共培養(yǎng)48h后HUVEC的增殖量；
[0020] 圖6示出了MSC和HUVEC共培養(yǎng)7 2h后HUVEC的增殖量；
[0021] 圖7示出了MSC/HUVEC不同比例促進(jìn)HUVEC的增殖；
[0022] 圖8示出了MSC/HUVEC不同比例促進(jìn)HUVEC的增殖；
[0023]圖9示出了不同來源的MSC樣品促進(jìn)HUVEC的增殖；
[0024]圖10示出了激光多普勒檢測缺血下肢的血流灌注量，證明MSC在體內(nèi)能夠促進(jìn)血 管新生。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方案對本發(fā)明進(jìn)行說明，具體實(shí)施方案應(yīng)該理解為僅為 舉例說明，不是限定性的，不應(yīng)以下述舉例說明來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026]本實(shí)施方式中，共培養(yǎng)體系中，在上腔中種植MSC，通過分泌因子而不是直接接觸 作用于下腔的HUVEC，促進(jìn)HUVEC的增殖，應(yīng)用CCK8試劑盒檢測HUVEC的增殖數(shù)量，以此來衡 量MSC促血管新生能力，評價(jià)其生物學(xué)效力。
[0027]以下對MSC促血管新生能力的量化和評價(jià)進(jìn)行說明。在本實(shí)施方式中，內(nèi)皮細(xì)胞采 用HUVEC。具體方法如下：
[0028] (1)從臍帶中分離HUVEC細(xì)胞，在T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是37°C，5 % C〇2〇
[0029] (2)將MSC和培養(yǎng)后的HUVEC共培養(yǎng)，共培養(yǎng)條件為:上下腔中MSC/HUVEC為1/10,共 培養(yǎng)72h后按照CCK8的試劑盒說明加入CCK8檢測液，孵育2h后檢測細(xì)胞增殖的數(shù)量和VEGF 因子的量。
[0030] (3)由HUVEC細(xì)胞增殖的數(shù)量和VEGF因子的量，對MSC的促血管新生能力進(jìn)行定量 和評價(jià)。
[0031] 細(xì)胞增殖的數(shù)量和VEGF因子的量的檢測，通過以下方法進(jìn)行。
[0032] 通過共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：1)制作HUVEC細(xì)胞數(shù)與0D值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線;2)制 作VEGF因子的量與HUVEC細(xì)胞數(shù)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0033]孵育2h后取其上清液進(jìn)行酶標(biāo)0D450/630的測定，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線對細(xì)胞增殖的數(shù) 量以及分泌的因子數(shù)進(jìn)行分析得到。
[0034]以下以實(shí)施例的方式對共培養(yǎng)體系的建立和條件進(jìn)行說明。
[0035]實(shí)施例1.HUVEC細(xì)胞的擴(kuò)增及鑒定
[0036] 從新鮮的臍帶中分離得到HUVEC細(xì)胞，種在T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中在37°C，5 %⑶2進(jìn)行 培養(yǎng)，培養(yǎng)到P5代，對細(xì)胞進(jìn)行表型鑒定。鑒定的結(jié)果如表一和圖1所示，細(xì)胞保持明顯的HUVEC形態(tài)和特征。
[0037]表一、HUVEC表型鑒定
[0039]實(shí)施例2.CCK8孵育時(shí)間的選擇及HUVEC標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定。
[0040] 在24孔板中種植不同密度HUVEC細(xì)胞，待貼壁后，按照CCK8試劑盒使用說明加入CCK8檢測液進(jìn)行孵育，分別在孵育2h和4h的時(shí)候取部分上清液進(jìn)行酶標(biāo)測定(0D450/630)， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示孵育不同時(shí)間后檢測的活細(xì)胞數(shù)與0D值均存在一定的線性關(guān)系。圖2是CCK8 孵育2h后標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖3是CCK8孵育4h后標(biāo)準(zhǔn)曲線。隨著孵育時(shí)間的延長，0D值變大，但是 2hr和4hr的斜率是一樣的，所對應(yīng)的細(xì)胞數(shù)一樣。最終確定孵育時(shí)間為2h，即最佳孵育時(shí)間 為2h。
[0041]實(shí)施例3.共培養(yǎng)時(shí)間的選擇及VEGF標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定
[0042] 在24孔板中種植HUVEC細(xì)胞，饑餓培養(yǎng)后正常培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中添加VEGF因子，梯 度為4ng，2ng，lng，Ong，每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，以此繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測共培養(yǎng)體系中MSC分泌 到培養(yǎng)液中的VEGF因子的量。選取剩余孔加懸掛式培養(yǎng)皿（transwell)，在transwell中種 植1^(：肩3(：/!1爪^(：細(xì)胞數(shù)的比為2/15、