用于鑒定嗜群血蜱的靶序列、引物、鑒定方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蜱蟲檢測與鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及用于鑒定嗜群血蜱 (Haemaphysalisconcinna)的革E1序列、特異性引物對、鑒定方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna)屬硬蜱科，血蜱屬，廣泛分布于我國北方草 原地區(qū)（包括黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙、甘肅、寧夏和新疆等）。另外，嗜群血蜱還分布于國 外蒙古國、日本、朝鮮、伊朗、土耳其以及捷克、羅馬尼亞、德國等廣大地區(qū)。其成蜱主要寄生 于大型哺乳類動物（包括有蹄類和食肉類），也侵襲人。幼蜱和若蜱寄生于小型哺乳類動物 及鳥類。嗜群血蜱作為媒介可傳播森林腦炎、Q熱、北亞蜱媒斑點熱等疫病。
[0003] 目前，嗜群血蜱的物種鑒定主要依靠形態(tài)學特征，該鑒定方法對鑒定者的專業(yè)知 識和蜱蟲樣本完整性均要求較高，又由于蜱蟲易與形態(tài)近似種混淆，造成嗜群血蜱的鑒定 結(jié)果費時、費力且準確度和重復性都不高。近年來，分子生物學技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于物 種鑒定，目前在嗜群血蜱的鑒定方面報道較少，Genbank數(shù)據(jù)庫中有嗜群血蜱的C0I序列， 但是其與Genbank數(shù)據(jù)庫中的已認證的另外一個參考序列（NCBIreferencesequence) Haemaphysalisparva(NC020335. 1) 一 致，而該序列明確說明是屬于Haemaphysalis parva，因此申請人認為目前Genbank數(shù)據(jù)庫中公開的C0I序列并非是嗜群血蜱 (Haemaphysalisconcinna)的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一個目的在于克服現(xiàn)有檢測技術(shù)的不足，提供一種用于鑒定嗜群血蜱 的特異性靶序列。
[0005] 本發(fā)明的第二個目的在于提供用于擴增特異性靶序列的引物對。
[0006] 本發(fā)明的第三個目的在于提供鑒定嗜群血蜱的方法及試劑盒。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先利用發(fā)明人設(shè)計的蜱蟲C0I全長序列擴增引物對嗜 群血蜱的C0I序列進行擴增。
[0008] C0I-CF:5'-ATTTTACCGCGATGAATATTYTC-3'（SEQIDN0. 4)
[0009] C0I-CR:5'-TTATTTTAAAATAATRTT-3'（SEQIDNO. 5)。
[0010] 上述序列中，Y和R分別為兼并引物，Y=C/T，R=A/G。
[0011] C0I-CF與C0I-CR擴增出嗜群血蜱的C0I全長序列，長1539bp，其電泳圖如圖1所 不。
[0012] 本發(fā)明根據(jù)擴增引物C0I-CF和C0I-CR擴增的嗜群血蜱的C0I全長序列，通過 MEGA軟件中CLUSTALW程序，將該序列與Genbank數(shù)據(jù)庫以及發(fā)明人擴增的同屬其他血蜱 C0I序列進行比對分析，篩選出嗜群血蜱特異性序列并設(shè)計擴增引物，共設(shè)計正向引物2 條，反向引物2條。它們分別為：
[0013] 正向引物HC-F:5'CTCTTCTTTAGTAGAAAGTGGTGT3'（如SEQIDN0. 2 所示）
[0014] 反向引物HC-R:5'GGTCAAAAAATGAAGTATTGAAG3'（如SEQIDNO. 3 所示）。
[0015]正向引物HC-F1 :5' -ATATCCGCCCCTTTCT-3'（如SEQIDNO. 6 所示）
[0016] 反向引物HC-R1 :5' -ATTCGTTCTAAGGTCATG-3'（如SEQIDNO. 7 所示）
[0017] 使用HC-F1以及HC-R1引物進行擴增時，除了嗜群血蜱，部分長角血蜱也能擴增出 相應(yīng)大小條帶。相比HC-F和HC-R其擴增特異性較差，因此選用HC-F和HC-R引物對。
[0018] 經(jīng)實際PCR擴增驗證，確定正向引物HC-F以及反向引物HC-R擴增效果良好，特異 性強。弓丨物設(shè)計BLAST比對結(jié)果如圖2,圖3所示。
[0019] 設(shè)計嗜群血蜱特異性引物并進行PCR擴增。嗜群血蜱獲得323bp的DNA特異性條 帶，對其進行測序、BLAST比對，確定該特異性DNA序列可作為鑒定嗜群血蜱的特異性DNA序 列，用于鑒定嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna)。
[0020] 本發(fā)明首先提供一種用于鑒定嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna)的革El序列，其 具有SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列。
[0021 ] 本發(fā)明提供了上述靶序列在鑒定嗜群血蜱中的應(yīng)用。
[0022] 用于上述靶序列的特異性引物對屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0023] 本發(fā)明提供了特異性擴增上述靶序列的特異性引物對，其核苷酸序列如SEQID Ν0· 2、3 所示。
[0024] 本發(fā)明提供了上述特異性引物對在制備鑒定嗜群血蜱（Haemaphysalis concinna)試劑盒中的應(yīng)用。
[0025] 進一步，本發(fā)明提供鑒定嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna)的方法，以待測昆 蟲樣品總DNA為模板，以SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列為靶序列，利用本發(fā)明提供的特異 性引物對進行PCR，根據(jù)擴增條帶的大小判定結(jié)果。
[0026] 更進一步地，若擴增條帶大小為323bp，則待測昆蟲樣本為嗜群血蜱。
[0027] 本發(fā)明的鑒定嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna)的方法中，50μ1PCR反應(yīng) 體系為：l〇XPCRbuffer5yl、10mM上、下游引物各 2yl、10mMdNTPs2yl、50U的Taq酶 1μ1，10~20ngDNA模板2μ1，加滅菌雙蒸水至50μ1;
[0028]PCR反應(yīng)程序：預(yù)熱 94°C，5min;94°C30s，48°C30s，72°C30s，共 36 個循環(huán)；延伸 72°C，7min，4°C保存。
[0029] 本發(fā)明還提供一種用于鑒定嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna)的試劑盒，含有 核苷酸序列如SEQIDN0. 2、3所示的引物對。
[0030] 本發(fā)明提供了該試劑盒在鑒定嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna)中的用途。
[0031] 本發(fā)明提供了用于鑒定嗜群血蜱的靶序列。本發(fā)明還克服了傳統(tǒng)嗜群血蜱鑒定對 標本完整性要求高、需要專業(yè)分類專家、鑒定成本高等問題，提供的鑒定嗜群血蜱的PCR引 物及鑒定方法彌補現(xiàn)有檢測技術(shù)的不足，操作簡便快捷，靈敏度高、特異性強、簡單快速、成 本低，提高了嗜群血蜱鑒定的效率和準確性，能夠滿足嗜群血蜱快速、準確的物種分子鑒定 需求。適用于嗜群血蜱分布調(diào)查，種群分析及相關(guān)蜱傳疫病的控制等研究分析工作，具有重 要的理論意義和應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0032] 圖1發(fā)明人設(shè)計蜱蟲C0I全長序列擴增引物對C0I-CF/C0I-CR，并用引物對擴增 嗜群血蜱的COI全長序列。PCR擴增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖；其中M:DL2000Mariier;1 : 1# 嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna)
[0033] 圖2為本發(fā)明設(shè)計的嗜群血蜱正向擴增引物HC-F序列與Genbank數(shù)據(jù)庫以及發(fā) 明人擴增的同屬其他血蜱C0I序列進行BLAST比對分析的結(jié)果；其中1 :HC-F引物序列； 2 :發(fā)明人擴增的1#嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna)C0I序列；3 :發(fā)明人擴增的1#草 原血蜱（Haemaphysalisverticalis)COI序列；4 :發(fā)明人擴增的1#日本血蜱（japonica longicornis)C0I序列；5 :發(fā)明人擴增的 1# 長角血蜱（HaemaphysalisHaemaphysalis) C0I序列；6:Genbank數(shù)據(jù)庫中的褐黃血婢（Haemaphysalisflava)C0I序列；7:Genbank 數(shù)據(jù)庫中的碩鼠血蜱（Haemaphysalishumerosa)C0I序列；8 :Genbank數(shù)據(jù)庫中的狐猴血 蜱（Haemaphysalislemuris)C0I序列；9:Genbank數(shù)據(jù)庫中的長棘血蜱（Haemaphysalis punctata)C0I序列；
[0034] 圖3為本發(fā)明設(shè)計的嗜群血蜱反向擴增引物HC-R序列與Genbank數(shù)據(jù)庫以及發(fā) 明人擴增的同屬其他血蜱C0I序列進行BLAST比對分析的結(jié)果；其中1 :HC-R引物序列； 2 :發(fā)明人擴增的1#嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna)C0I序列；3 :發(fā)明人擴增的1#草 原血蜱（Haemaphysalisverticalis)COI序列；4 :發(fā)明人擴增的1#日本血蜱（japonica longicornis)C0I序列；5 :發(fā)明人擴增的 1# 長角血蜱（HaemaphysalisHaemaphysalis) C0I序列；6:Genbank數(shù)據(jù)庫中的褐黃血婢（Haemaphysalisflava)C0I序列；7:Genbank 數(shù)據(jù)庫中的碩鼠血蜱（Haemaphysalishumerosa)C0I序列；8 :Genbank數(shù)據(jù)庫中的狐猴血 蜱（Haemaphysalislemuris)C0I序列；9:Genbank數(shù)據(jù)庫中的長棘血蜱（Haemaphysalis punctata)C0I序列；
[0035] 圖4為用本發(fā)明設(shè)計的特異性引物對蜱蟲DNA樣本進行PCR檢測的1 %瓊脂糖 凝膠電泳圖；其中M:DL2000Marker;1 :1# 草原革蜱（Dermacentornuttalli) ;2:2# 草 原革蜱（Dermacentornuttalli) ;3:全溝硬蜱（Ixodespersuleatus) ;4:1# 日本血蜱 (Haemaphysalisjaponica) ;5:2# 日本血蜱（Haemaphysalisjaponica) ;6:1# 長角血蜱 (Haemaphysalislongicornis) ;7:2# 長角血蜱（Haemaphysalislongicornis) ;8 : 1# 亞 洲璃眼蜱（Hyalommaasiaticum) ;9:2# 亞洲璃眼蜱（Hyalommaasiaticum) ;10 :草原血蜱 (Haemaphysalisverticalis) ;11:1#嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna) ;12:2#嗜群血 婢（Haemaphysalisconcinna)〇
【具體實施方式】
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