熒光定量多重直擴(kuò)q(RT)-PCR方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種熒光定量多重直擴(kuò)q(RT)-PCR方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人類文明持續(xù)向前推進(jìn)，各種病毒接踵而來(lái)，同一疾病可以是不同的病毒感 染，同一病毒的不用亞型可能出現(xiàn)不同的臨床表征。從乙肝病毒HBV、艾滋病毒HIV，再到近 年的甲型流感H1N1、H3N2，禽流感H5N1、H7N9、H9N2，手足口病毒EV71、CA16等，每一次病毒爆 發(fā)和流行都嚴(yán)重威脅到人類的健康，給病毒的檢測(cè)帶來(lái)極大的困擾。
[0003]病毒的檢測(cè)是人們?cè)谂c病毒的斗爭(zhēng)中重要的技術(shù)，熒光定量PCR檢測(cè)由于其很高 的特異性、靈敏性和重復(fù)性，目前已廣泛用于甲型流感、禽流感等病毒的診斷。但是，傳統(tǒng)的 熒光定量PCR檢測(cè)方法通常以純化的核酸分子(DNA或RNA)為模板，單通道檢測(cè)的制約無(wú)法 區(qū)分病毒種類及亞型，導(dǎo)致檢測(cè)周期長(zhǎng)且感染的多病毒或針對(duì)同一病毒的不同亞型區(qū)分結(jié) 果不明確。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]基于此，有必要提供一種無(wú)需從樣本中提取核酸分子并且可以同時(shí)檢測(cè)多重病毒 或同一病毒的不同亞型的熒光定量多重直擴(kuò)q(RT)_PCR方法。
[0005] -種熒光定量多重直擴(kuò)q(RT)_PCR方法，包括如下步驟：
[0006]提供特異性擴(kuò)增引物和探針，所述異性擴(kuò)增引物選自第一組引物、第二組引物和 第三組引物中的兩種或三種，所述第一組引物、所述第二組引物和所述第三組引物分別針 對(duì)不同種類的病毒或同種病毒的不同亞型的序列保守區(qū)設(shè)計(jì)，所述探針選自第一探針、第 二探針和第三探針中的兩種或三種，所述第一探針對(duì)應(yīng)于所述第一組引物，所述第二探針 對(duì)應(yīng)于所述第二組引物，所述第三探針對(duì)應(yīng)于所述第三組引物；
[0007]將待檢測(cè)樣本與蛋白質(zhì)變性液混合，使得所述待檢測(cè)樣本中的病毒核酸分子釋 放，得到混合樣本；
[0008] 將所述混合樣本預(yù)熱后與PCR反應(yīng)預(yù)混液混合，得到反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)預(yù)混液 包括所述特異性擴(kuò)增引物和所述探針；以及
[0009]將所述反應(yīng)液置于熒光定量PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0010] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述第一探針、所述第二探針和所述第三探針均為T(mén)aqman探針， 并且所述第一探針、所述第二探針和所述第三探針的5'端分別標(biāo)記了不同種類的熒光基 團(tuán)。
[0011]在一個(gè)實(shí)施例中，將所述混合樣本預(yù)熱的操作中，所述預(yù)熱的溫度為55°C~70°C， 所述預(yù)熱的時(shí)間為l〇min~15min。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)變性液包括異硫氰酸胍、檸檬酸鈉、十二烷基肌酸 鈉、巰基乙醇和蛋白酶K。
[0013]在一個(gè)實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)變性液中，所述異硫氰酸胍的濃度為0.2mol/L~ 2mol/L，所述檸檬酸鈉的濃度為10mm〇l/L~30mmol/L，所述十二烷基肌酸鈉的質(zhì)量濃度為0.2%~1%，所述β-巰基乙醇的濃度為0.05moVL~0.lmol/L，所述蛋白酶K的濃度為lmg/ mL~5mg/mL〇
[0014] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述待檢測(cè)樣本與所述蛋白質(zhì)變性液的體積比為1:1~2。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述PCR反應(yīng)預(yù)混液還包括PCR反應(yīng)緩沖溶液和反應(yīng)酶系；
[0016] 所述PCR反應(yīng)緩沖溶液包括Tris-HCl、硫酸銨、氯化鉀、Tween 20和硫酸鎂；
[0017] 所述反應(yīng)酶系包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、BSA、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNasin。
[0018] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述Tris-HCl在所述PCR反應(yīng)緩沖溶液中的終濃度為10mmol/L ~65mmol/L;
[0019] 所述硫酸銨在所述PCR反應(yīng)緩沖溶液中的終濃度為10mmol/L~20mmol/L;
[0020] 所述氯化鉀在所述PCR反應(yīng)緩沖溶液中的終濃度為40mmol/L~80mmol/L;
[0021] 所述Tween20與所述PCR反應(yīng)緩沖溶液的體積比為0·01~2:100;
[0022]所述硫酸鎂在所述PCR反應(yīng)緩沖溶液中的終濃度為2mmol/L~5mmol/L;
[0023] 所述TaqDNA聚合酶為改良的可抗抑制劑的TaqDNA聚合酶；
[0024]所述逆轉(zhuǎn)錄酶為改良的可以提高逆轉(zhuǎn)錄效率和特異性的逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0025]在一個(gè)實(shí)施例中，所述待檢測(cè)樣本包括血清、血漿、口鼻腔粘液、尿液和糞便中的 至少一種；
[0026]所述待檢測(cè)樣本中的病毒包括乙肝病毒HBV、艾滋病毒HIV、甲型流感H1N1病毒、甲 型流感H3N2病毒、禽流感病毒和手足口病毒中的至少一種。
[0027]在一個(gè)實(shí)施例中，所述禽流感病毒為H5N1、H7N9和H9N2中的至少一種;所述手足口 病毒為EV71和CA16中的至少一種。
[0028] 上述熒光定量多重直擴(kuò)q(RT)_PCR方法，針對(duì)檢測(cè)兩種或三種不同病毒或同一病 毒不同亞型的序列保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物和探針，不同的探針序列采用不同的熒光基 團(tuán)標(biāo)記，并將待檢測(cè)樣本與蛋白質(zhì)變性液混合，使得待檢測(cè)樣本中的病毒核酸分子釋放;混 合樣本預(yù)熱后與PCR反應(yīng)預(yù)混液混合并置于熒光定量PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。這種熒光定量 多重直擴(kuò)q(RT) -PCR方法不需要以純化的核酸分子(DNA或RNA)為模板，待檢測(cè)樣本在蛋白 質(zhì)變性液的作用下，樣本中的病毒核酸分子釋放，省去了從樣本中提取核酸分子步驟。同 時(shí)，PCR反應(yīng)預(yù)混液中含有多組特異性擴(kuò)增引物和探針，不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的探針隨病毒核 酸分子擴(kuò)增產(chǎn)生熒光信號(hào)不同。與傳統(tǒng)的方法相比，這種熒光定量多重直擴(kuò)q(RT)_PCR方法 無(wú)需從樣本中提取核酸分子，直接進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，且在同一反應(yīng)體系中可以區(qū)分不 同的病毒或同一病毒的不同亞型，具有實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，可縮短檢測(cè)周期，節(jié)約檢測(cè)成本，易 于進(jìn)行高通量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。特別是，當(dāng)檢測(cè)樣本較少時(shí)，由于不需要從樣本中提取和純化 DNA，這種熒光定量多重直擴(kuò)q(RT)_PCR方法也可實(shí)現(xiàn)核酸分子的檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1為一實(shí)施方式的熒光定量多重直擴(kuò)q(RT)_PCR方法的流程圖；
[0030]圖2為實(shí)施例1中優(yōu)化前的熒光定量PCR檢測(cè)圖；
[0031]圖3為實(shí)施例1中優(yōu)化后的熒光定量PCR檢測(cè)圖；
[0032]圖4為實(shí)施例2中采用優(yōu)化好的反應(yīng)液和反應(yīng)條件含有EV71病毒的陽(yáng)性咽拭子樣 本的熒光定量PCR檢測(cè)圖；
[0033]圖5為實(shí)施例2中采用優(yōu)化好的反應(yīng)液和反應(yīng)條件含有CoxA16病毒的陽(yáng)性咽拭子 樣本的熒光定量PCR檢測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面主要結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)熒光定量多重直擴(kuò)q(RT)_PCR方法作進(jìn)一步詳 細(xì)的說(shuō)明。
[0035]如圖1所示的一實(shí)施方式的熒光定量多重直擴(kuò)q(RT)_PCR方法，包括如下步驟： [0036]S110、提供特異性擴(kuò)增引物和探針。
[0037]異性擴(kuò)增引物選自第一組引物、第二組引物和第三組引物中的兩種或三種，第一 組引物、第二組引物和第三組引物分別針對(duì)不同種類的病毒或同種病毒的不同亞型的序列 保守區(qū)設(shè)計(jì)。
[0038]探針選自第一探針、第二探針和第三探針中的兩種或三種，第一探針對(duì)應(yīng)于第一 組引物，第二探針對(duì)應(yīng)于第二組引物，第三探針對(duì)應(yīng)于第三組引物。
[0039] 引物的設(shè)計(jì)可遵循以下原則：引物序列可選取待檢測(cè)的病毒核酸分子的序列保守 區(qū)，不能有堿基變異;檢測(cè)mRNA時(shí)，為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯子；弓丨 物的TM值(解鏈溫度)為60°C左右，上游引物和下游引物之間的TM值相差一般不超過(guò)2°C;弓丨 物長(zhǎng)度一般為18~25bp。
[0040] 探針的設(shè)計(jì)可遵循以下原則:探針位置盡可能地靠近上游引物;探針的TM值為70 °C左右，通常比引物的TM值高5~10°C;探針長(zhǎng)度一般為15~45bp;探針的5'端應(yīng)避免使用G (鳥(niǎo)嘌呤），因?yàn)?'的G會(huì)有淬滅作用，而且即使是被切割下來(lái)還會(huì)存在淬滅作用，影響定量； 整條探針中，C(胞嘧啶）的含量要明顯高于G(鳥(niǎo)嘌呤）的含量，因?yàn)镚含量高會(huì)降低反應(yīng)效 率，這時(shí)就應(yīng)選擇配對(duì)的另一條鏈作為探針。
[0041] -般的，為確保引物和探針的特異性，最好將設(shè)計(jì)好的序列在序列分析軟件中分 析二級(jí)結(jié)構(gòu)，并用Blast分析特異性，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，需要重新設(shè)計(jì)引物和探 針。
[0042] 待檢測(cè)樣本中的病毒可以為乙肝病毒HBV、艾滋病毒HIV、甲型流感H1N1病毒、甲型 流感H3N2病毒、禽流感病毒和手足口病毒中的至少一種。
[0043] 禽流感病毒可以為H5NUH7N9和H9N2中的至少一種；手足口病毒可以為EV71和 CA16中的至少一種。
[0044] 具體的，探針可以為帶有焚光基團(tuán)的物質(zhì)，如Taqman探針。TaqMan探針是一種寡核 苷酸:5'端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā) 射的熒光信號(hào)被淬滅熒光基團(tuán)吸收。PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5 ' -3 '外切酶將探針酶切降解，使 報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條 DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。
[0045] 引發(fā)