]以相對于工序（1)中第1含纖維素生物質(zhì)的前處理物的固體成分重量為1~50%的 范圍的量添加第2含纖維素生物質(zhì)。這里所說的固體成分重量，是指使第1含纖維素生物質(zhì) 的前處理物和/或第2含纖維素生物質(zhì)或其前處理物在105°C下干燥后的重量，通過使用加 熱干燥?質(zhì)量測定方式的水分計來測定含水率，能夠逆運算出第1含纖維素生物質(zhì)的前處 理物和/或第2含纖維素生物質(zhì)或其前處理物的固體成分濃度。例如，在第1含纖維素生物質(zhì) 的前處理物的含水率為70%、第2含纖維素生物質(zhì)或其前處理物的含水率為10 %的情況下， 其固體成分濃度分別是30%、90%。第1含纖維素生物質(zhì)的前處理物的濕重150g相當(dāng)于固體 成分45g，第2含纖維素生物質(zhì)或其前處理物的添加量為固體成分0.45~22.5g，即相當(dāng)于濕 重O·5~25g〇
[0039] 在本發(fā)明中，使用源自絲狀菌的纖維素酶來水解第1含纖維素生物質(zhì)的前處理物 和第2含纖維素生物質(zhì)或其前處理物。作為絲狀菌，可舉出木霉屬（Trichoderma)、曲霉屬 (Aspergillus)、纖維單胞菌屬（Cel Iulomonas )、梭菌屬（Clostridium )、鏈霉菌屬 (Streptomyces)、腐質(zhì)霉屬（Humicola)、枝頂孢霉屬(Acremonium)、耙齒菌屬（Irpex)、毛霉 屬(Mucor )、籃狀菌屬(Talaromyces)等的微生物。此外，也可以是源自利用誘變劑或紫外線 照射等對這些微生物進(jìn)行了突變處理從而纖維素酶生產(chǎn)性提高了的突變株的纖維素酶。
[0040] 由于絲狀菌中木霉屬在培養(yǎng)液中大量地生產(chǎn)在纖維素的水解中比活性高的酶成 分，因此可以在本發(fā)明中優(yōu)選使用。作為源自木霉屬的纖維素酶的具體例子，可舉出源自里 氏木霉QM9414(Trichoderma reesei QM9414)、里氏木霉QM9123(Trichoderma reesei QM9123)、里氏木霉RutC_30(Trichoderma reesei RutC-30)、里氏木霉PC3-7(Trichoderma reesei PC3-7)、里氏木霉CL-847(Trichoderma reesei CL-847)、里氏木霉MCG77 (Trichoderma reesei MCG77)、里氏木霉MCG80(Trichoderma reesei MCG80)、綠色木霉 QM9123 (Trichoderma Viride QM9123)的纖維素酶，其中更優(yōu)選源自里氏木霉的纖維素酶。
[0041] 源自絲狀菌的纖維素酶是具有將纖維素和/或半纖維素水解并生成葡萄糖、木糖 等單糖的活性的酶組合物，作為酶成分，優(yōu)選包含選自纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β_ 葡糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶中的1種以上。例如，作為源自里氏木霉的纖維素酶的酶 成分，可示例纖維二糖水解酶I、纖維二糖水解酶II、內(nèi)切葡聚糖酶I、內(nèi)切葡聚糖酶ΙΙΙ、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、木糖苷酶等，由于這樣通過多種酶成分的協(xié)同效果或互補效果能夠 有效地進(jìn)行纖維素和/或半纖維素的水解，因此在本發(fā)明中優(yōu)選使用。
[0042]纖維二糖水解酶是通過纖維素鏈的水解而釋放纖維二糖的酶的總稱，作為EC編 號:EC3.2.1.91，記載了歸屬于纖維二糖水解酶的酶群。纖維二糖水解酶I從纖維素鏈的還 原末端側(cè)開始水解反應(yīng)，纖維二糖水解酶II從非還原末端側(cè)開始水解反應(yīng)。
[0043]內(nèi)切葡聚糖酶是以從纖維素鏈的中央部分開始水解為特征的酶的總稱，作為EC編 號:EC3.2.1.4，記載了歸屬于內(nèi)切葡聚糖酶的酶群。
[0044] 所謂β-葡糖苷酶，是以作用于纖維寡糖或纖維二糖為特征的酶的總稱，作為EC編 號:EC3.2.1.21，記載了歸屬于β-葡糖苷酶的酶群。
[0045] 所謂木聚糖酶，是以作用于半纖維素或特別作用于木聚糖為特征的酶的總稱，作 為EC編號:EC3.2.1.8,記載了歸屬于木聚糖酶的酶群。
[0046] 所謂β-木糖苷酶，是以作用于木寡糖為特征的酶的總稱，作為EC編號： EC3.2.1.37，記載了歸屬于木糖苷酶的酶群。
[0047] 這樣的纖維素酶成分通過凝膠過濾、離子交換、二維電泳等公知手法進(jìn)行分離，對 分離出的成分進(jìn)行氨基酸序列分析(Ν末端分析、C末端分析、質(zhì)量分析），通過與數(shù)據(jù)庫比較 可以進(jìn)行鑒定。
[0048]此外，源自絲狀菌的纖維素酶的酶活性可以以結(jié)晶纖維素、羧甲基纖維素(CMC)、 纖維二糖、木聚糖、甘露聚糖等多糖作為底物，根據(jù)其水解活性進(jìn)行評價。顯示結(jié)晶纖維素 分解活性的主要的酶是具有從纖維素末端部分水解的特征的纖維二糖水解酶。顯示纖維二 糖分解活性的主要的酶是葡糖苷酶。與CMC分解活性相關(guān)的主要的酶是纖維二糖水解酶、 內(nèi)切葡聚糖酶。顯示木聚糖分解活性的主要的酶是木聚糖酶、木糖苷酶。這里"主要的"的 意思是來自已知與分解最相關(guān)的表達(dá)方式，意思是其以外的酶成分也與其分解相關(guān)。
[0049] 由于絲狀菌在培養(yǎng)液中產(chǎn)生纖維素酶，因此可以將其培養(yǎng)液作為粗酶物直接使 用，也可以將以公知的方法將酶群純化并制劑化而得的制品作為源自絲狀菌的纖維素酶混 合物使用。在使用將源自絲狀菌的纖維素酶純化并制劑化而得的制品的情況下，也可以將 添加了蛋白酶抑制劑、分散劑、溶解促進(jìn)劑、穩(wěn)定劑等酶以外的物質(zhì)的制劑作為纖維素酶制 劑使用。另外，在本發(fā)明中優(yōu)選使用其中的粗酶物。粗酶物源自在為了使絲狀菌產(chǎn)生纖維素 酶而調(diào)制的培養(yǎng)基中將該微生物培養(yǎng)任意時間而得的培養(yǎng)上清。對使用的培養(yǎng)基成分不特 別限定，但是為了促進(jìn)纖維素酶的產(chǎn)生，一般可以使用添加了纖維素的培養(yǎng)基。而且，作為 粗酶物，優(yōu)選直接使用培養(yǎng)液，或使用僅除去了木霉菌體的培養(yǎng)上清。
[0050] 對粗酶物中的各酶成分的重量比不特別限定，例如，源自里氏木霉的培養(yǎng)液中含 有50~95重量％的纖維二糖水解酶，其余成分包含內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶等。此外，木 霉屬的微生物在培養(yǎng)液中產(chǎn)生強的纖維素酶成分，另一方面由于葡糖苷酶大多保持在細(xì) 胞內(nèi)或細(xì)胞表層，因而培養(yǎng)液中的葡糖苷酶活性低。因此可以在粗酶物中進(jìn)一步添加異 種或同種的葡糖苷酶。作為異種的葡糖苷酶，可以優(yōu)選使用源自曲霉屬的葡糖苷酶。 作為源自曲霉屬的β -葡糖苷酶，可以示例出由/求f彳么社市售的Novozymel88等。此外， 還可以培養(yǎng)以向木霉屬的微生物導(dǎo)入基因使其在其培養(yǎng)液中產(chǎn)生葡糖苷酶的方式進(jìn)行 基因重組而得的木霉屬的微生物，從而使用葡糖苷酶活性提高了的培養(yǎng)液。
[0051 ]對第1含纖維素生物質(zhì)的前處理物和第2含纖維素生物質(zhì)或其前處理物的固體成 分濃度不特別限定，但是優(yōu)選1~30重量％的范圍。如果考慮生成的糖濃度和操作性，則設(shè) 定為該固體物濃度是有利的。
[0052] 對于水解反應(yīng)的溫度，只要依照源自絲狀菌的纖維素酶的優(yōu)選的反應(yīng)條件就不特 別限定，優(yōu)選為30~75°C的范圍，特別是在使用源自木霉屬的纖維素酶的情況下，進(jìn)一步優(yōu) 選40~60°C的范圍。
[0053] 對于水解反應(yīng)的pH值也是同樣，只要依照源自絲狀菌的纖維素酶的優(yōu)選的反應(yīng)條 件就不特別限定，優(yōu)選pH值為3.0~7.0的范圍，進(jìn)一步優(yōu)選pH值為4.0~6.0的范圍。在使用 源自木霉屬的纖維素酶作為源自絲狀菌的纖維素酶的情況下，其反應(yīng)最適PH值為5.0。進(jìn) 而，由于在水解的過程中pH值發(fā)生變化，因此優(yōu)選一邊向反應(yīng)液中添加緩沖液或者使用酸、 堿來保持一定pH值，一邊進(jìn)行。
[0054] 水解反應(yīng)的時間優(yōu)選為2小時~200小時的范圍。將水解反應(yīng)的時間設(shè)定為該范圍 在生成充分的糖和防止回收纖維素酶失活方面是有利的。
[0055] 工序(3):將工序(2)的水解物固液分離為溶液成分和水解殘渣，使溶液成分通過 超濾膜進(jìn)行過濾，作為非透過液回收源自絲狀菌的纖維素酶，作為透過液回收糖液的工序
[0056] 將由工序(2)獲得的水解物固液分離而獲得的溶液成分中包含源自絲狀菌的纖維 素酶成分和糖成分，它們可以通過使用超濾膜的過濾來分離。
[0057] 超濾膜是指截留分子量為500~200,000的膜，簡稱為Ultra filtration膜、UF膜 等。此外，超濾膜孔徑過小，難以用電子顯微鏡等對膜表面的細(xì)孔徑進(jìn)行計測，因此用截留 分子量的值來代替平均細(xì)孔徑作為孔徑大小的指標(biāo)。所謂截留分子量，像在日本膜學(xué)會編 膜學(xué)実験シリ一ス'(膜學(xué)實驗系列)第III卷人工膜編編集委員/木村尚史?中尾真一 ?大矢 晴彥?仲川勤（1993年，共立出版）的第92中的記載："溶質(zhì)(7)分子量旮橫軸K、阻止率旮縦 軸丨二i O Tf'-夕旮7°口 V卜Lfc也(7)旮分畫分子量曲線i上Ay-eV、S。乇LT阻止率私 90% t 分子量Sr膜(D分畫分子量t上Ay"CV、6。（以溶質(zhì)的分子量作為橫軸、以截留率 作為縱軸，將數(shù)據(jù)作圖而得的曲線叫做截留分子量曲線。而且將截留率為90%的分子量叫 做膜的截留分子量）。"那樣，其作為表示超濾膜的膜性能的指標(biāo)