一類用于治療心力衰竭的酰腙類衍生物的制作方法
【技術領域】：
[0001 ] 本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)一系列改善心肌收縮力的心肌球蛋白激動劑。這些化合物可能被 用于治療充血性心力衰竭（"CHF"）和/或心力衰竭（"HF"）。 技術背景：
[0002] 心力衰竭（heart failure)是人類常見疾病，具有發(fā)病率高、死亡率高、治療費用 高的特點。最新的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，美國年齡超過40歲的人群中有20%的人存在患心力衰竭 的風險，因心力衰竭而住院的患者30天、1年、5年的死亡率分別為10 %、20 %、42 %，5年死 亡率與惡性腫瘤相仿。在我國，40歲以上人群中約有超過400萬心衰患者，并且隨著人口 老齡化的加快，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。因此，心力衰竭嚴重影響著人類的健康和生活質 量，心力衰竭的治療及相關藥物的研發(fā)一直是醫(yī)藥學界亟待解決的問題。
[0003] 抗心衰藥物的研究經(jīng)歷了一個長期的過程，在抗心衰的藥物中，無論是利尿藥、神 經(jīng)內(nèi)分泌阻滯劑還是正性肌力藥物都發(fā)揮了各自的療效。然而，利尿藥和神經(jīng)內(nèi)分泌阻滯 劑只能緩解心衰癥狀，卻并不能改善心臟衰竭的本質，傳統(tǒng)的正性肌力藥物往往存在一定 的副作用。這種通過增加心肌細胞的鈣離子濃度，增強心肌的收縮能力的方法可以達到正 性肌力的作用，但是因為鈣離子濃度的變化，也會造成心律失常、心率加快和心肌耗氧量增 加等多種副作用的產(chǎn)生。
[0004] 怎樣在保證心肌細胞內(nèi)鈣離子濃度和CAMP水平穩(wěn)定的情況下增加心肌細胞收縮 力，成為正性肌力藥物開發(fā)關注的焦點。研究人員在這方面做了很多嘗試，并取得了一定的 成效。通過努力，研究人員發(fā)現(xiàn)了一種直接作用于心肌肌球蛋白的一種物質一心肌肌球蛋 白激動劑。
[0005] 心肌收縮力下降是心力衰竭的主要標志，為了維持穩(wěn)定的心血輸出量，機體通過 增加交感神經(jīng)張力、激活神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的方式代償性的增加心肌收縮力，但這往往會加 快心衰的進程，心肌收縮是由體內(nèi)信號轉導通路作用于肌原纖維節(jié)產(chǎn)生的節(jié)律性的收縮過 程。心肌肌球蛋白激動劑直接作用于心肌肌原纖維，因其調控的是心肌收縮的最下游靶點， 不影響細胞內(nèi)鈣離子濃度，避免了諸多不良反應的發(fā)生。
[0006] 鑒于當前藥物的局限性，需要新的方法來改善充血性心力衰竭，最近批準的短期 靜脈注射劑，卡米農(nóng)，距現(xiàn)在已經(jīng)20多年了。唯一有效的口腔藥物，地高辛，已經(jīng)有200多 年了。鑒此，我們急切需要采用全新作用機制的藥物，不論短期還是長期都能夠在緩解臨床 病癥、提高安全性和降低患者死亡率方面有更好的結果。相比于當前藥物，本專利藥物能選 擇性定向作用于心臟肌小節(jié)（例如靶向作用于心肌肌球蛋白），減少副作用，增加心肌 收縮力，從而達到治療心力衰竭的目的。本發(fā)明提供了該新型心肌肌球蛋白激動劑以及其 鑒別和使用的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007] 本文所述的化學實體對心肌肌原纖維節(jié)具有選擇性予以調節(jié)，可用于與其結合和 /或增強其活性、增加肌球蛋白水解ATP的速率，本說明書中所用的"調節(jié)"意指增加或降低 肌球蛋白活性，而"增強"則意指增加其活性，于本發(fā)明代表性化合物的測試中亦已確定，其 給藥可增加心肌肌原纖維的收縮力。
[0008] 本發(fā)明的化學實體、藥物組合物及方法可用于治療心臟疾病包括但不限于：急性 (或代償性）充血性心力衰竭和慢性充血性心力衰竭；特別是與收縮性心臟官能障礙相關 的疾病。其他治療用途包括給藥等待心臟移植的病患以穩(wěn)定心臟功能，及協(xié)助使用分流栗 后已停止或減緩的心臟恢復正常功能。
[0009] 肌原纖維節(jié)中的肌球蛋白利用ATP水解來產(chǎn)生力。因此，增加 ATP水解相當于增 加肌肉收縮力或速度。于肌動蛋白存在下，肌球蛋白的ATP酶活性被激發(fā)>100倍。因此， ATP水解不僅測量肌球蛋白酶活性，亦測量其與肌動蛋白絲的相互作用。調節(jié)心肌肌原纖 維節(jié)的化合物可利用肌球蛋白的增加或降低ATP水解速率予以鑒定，于特定具體實施方案 中，不小于10 μ mol (例如小于1 μ mol)的濃度下，展現(xiàn)該速率增加1. 4倍。此等活性的測 定可用至人類來源的肌球蛋白，但通常使用得自其它生物的肌球蛋白。亦使用于肌球蛋白 與輕裝飾的薄肌絲的結合中以鈣的調控角色為模式的系統(tǒng)。
[0010] 替代地，具生化功能的肌原纖維節(jié)制劑可用于體外測定ATP酶活性，例如：2000年 3月29日申請的美國專利09/539, 164中所述。肌原纖維節(jié)的功能性生化反應，包括ATP酶 水解的鈣敏感性，可通過組合其輕純化的各個成分（特別包括其調控成分與肌球蛋白）而 再組成。另一功能性制劑為體外能動性試驗，此試驗的進行是添加測試化合物至結合肌球 蛋白的載玻片上，然后觀察肌動蛋白絲在覆蓋肌球蛋白的玻璃表面滑動的情形。
[0011] ATP水解的體外速率與肌球蛋白增強活性有關，此可利用監(jiān)測ADP或磷酸鹽產(chǎn)生 予以測定，例如，1999年5月18日申請的美國專利09/314, 464中所述。ADP產(chǎn)生亦可利用 將該ADP產(chǎn)生與NADH氧化作用偶聯(lián)（使用丙酮酸激酶與乳酸脫氫酶等酶），并利用監(jiān)測吸 收光性或熒光予以探測。磷酸鹽產(chǎn)生可使用嘌呤核苷磷酸化酶使磷酸產(chǎn)生與嘌呤類似物的 切割偶聯(lián)，因而產(chǎn)生吸光率或熒光變化予以探測。雖可使用單一測定，但通常于不同的多次 測定以確定蛋白質活性的絕對比率：此等測定特別在與酶測定結果具有類似吸光或熒光性 質測定化合物存在下，具有較高的特異性。
[0012] 測試化合物可使用多孔板，于孔中個別放置化合物或使其呈混合物，以高度并行 方式進行測定。測試的成分包括目標蛋白質復合物、偶聯(lián)酶與底物，然后添加 ATP至各孔， 以板計讀器測定板中各孔的吸光率或熒光。
[0013] 有一方法使用384孔板板式與25微升反應體積，并使用丙酮酸激酶/乳酸脫氫酶 偶聯(lián)體系測定各孔中的ATP水解速率。如本領域技術人員所認知，測定用的諸成分添加在 緩沖劑及試劑中。由于本文概述的方法容許動力學測定，因此將培養(yǎng)時間最適化以得到相 對于背景的適當檢測信號。該測定是與獲得ATP水解動力學同時進行的，將增加測定中的 信噪比。
[0014] 心肌纖維ATP酶和/或收縮力的調節(jié)作用亦可使用經(jīng)清潔劑滲透的心肌纖維或肌 原纖維予以測定，例如，如 Haikala Η 等人（1995)J Cardiovasc pharmacol25(5):794_801 所述。去皮的心肌纖維保留其固有的肌原纖維節(jié)組織，但未保留細胞鈣周期的所有方面，此 模式具有兩項優(yōu)點：第一，細胞膜不是化合物滲透的屏障；第二，鈣濃度被控制。因此，ATP 酶或收縮力的任何增加成為測試化合物對肌原纖維節(jié)蛋白質影響的直接量度。ATP酶利用 上文敘述的方法進行測定。張力測量則是將肌纖維的一端固定于固定杵而另一端固定于可 測量力的轉化器上進行的。于伸展該纖維消除寬松后，力轉化器于纖維開始收縮時記錄增 加的張力。此測定稱為等長張力，因此不容許纖維變短。經(jīng)滲透的肌纖維的活化是如下進 行的：將其置于緩沖鈣溶液中，隨后添加測試化合物或對照組。以此方式進行測試時，本文 所述的化學實體于與生理收縮活性相關的諸鈣濃度下引起力的增加，而于低鈣濃度的松弛 緩沖液中或鈣不存在下，則力的增加極少。
[0015] 對心肌肌纖維節(jié)與肌球蛋白的選擇性可通過在上述一或多種試驗中以非心臟的 肌原纖維節(jié)成分與肌球蛋白取代，并將所得結果與使用心臟對等物所得的結果進行比較。
[0016] 于體外重組的肌原纖維節(jié)試驗或肌原纖維中所觀察的化學實體增加 ATP酶率的 能力可能源自S1-肌球蛋白轉化率的增加，或者，是由于輕裝飾的肌動蛋白絲對〇8++_活化 作用的敏感性增加。為了區(qū)分此二可能的作用模式，首先測定化學實體對具有未經(jīng)輕裝飾 的肌動蛋白絲的S1的ATP酶活性的影響。若觀察到活性增加，則可反駁化學實體對Ca-反 應調控結構的影響。第二，可使用更敏感的試驗鑒定于裝飾肌動蛋白存在下對S1-肌球蛋 白的活化作用增加的化學實體。于此第二試驗中，比較心臟-S1與骨骼-S1對經(jīng)心臟及骨 骼調控的肌動蛋白絲的活性。
[0017] 活體內(nèi)活性的初始評估可于肌細胞收縮性的細胞模式中進行測定，例如，如 Popping S等人與Wolska BM等人所述。肌細胞模式的一個優(yōu)點為可將收縮性產(chǎn)生變化的 成分系統(tǒng)分離并測定主要作用部位。然后可于整個器官模式中[例如具有心臟功能的離體 心臟模式、活體內(nèi)使用心臟超聲波或侵入性血液動力學測量法、及動物系心力衰竭模式例 如Rat Left Coronary Attery Occlusion模式]評估具有細胞活性的化學實體[例如，選 擇具有下述性質的化學實體：于2微摩爾時相較于基準的短縮分率增加>120%，或產(chǎn)生舒 張長度變化（〈5%)]。最后，于盲目、安慰劑控制的人類臨床試驗中證明其治療心臟疾病的 活性。
[0018] 本文所述的化學實體系以治療有效劑量進行給藥，例如，足以提供治療先前敘述 的疾病狀態(tài)的劑量。雖然對于化學實體的人類劑量尚未予以最適化，但通常日劑量為約 0. 05至100毫克/千克體重；于特定具體實施方案中，為約0. 10至10. 0毫克/千克體重， 及于特定具體實施方案中，為約〇. 15至1.0毫克/千克體重。因此，對給藥70千克重的人 而言，于特定具體實施方案中，劑量范圍為每天約3. 5至7000毫克；于特定具體實施方案 中，為每天約7. 0至700. 0毫克，及于特定具體實施方案中，為每天10. 0至100. 0毫克。所 給藥化學實體的量當然取決于所治療對象及疾病狀態(tài)、病嚴重性、給藥方式與療程及開藥 醫(yī)師的判斷；例如，視化合物藥物動力學而定，就經(jīng)口給藥而言，可能的劑量范圍為每天約 70至700毫克。
[0019] 本文所述化學實體的給藥可經(jīng)由給藥供應類似用途的制劑的任何被接受的模式， 包括但不限于經(jīng)口、舌下、皮下、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、局部、經(jīng)皮、腹膜內(nèi)。肌內(nèi)。肺內(nèi)、陰道內(nèi)、直 腸內(nèi)、或眼內(nèi)。經(jīng)口與非經(jīng)腸給藥為治療為本發(fā)明主題的適應癥的常用方式。
[0020] 藥物學上可接受的組合物包含固體、半固體、液體及氣溶膠劑型，例如，片劑、膠 囊、粉劑、液體、混懸劑、栓劑、氣溶膠等。化學實體亦可以持續(xù)或控制釋放的劑型給藥，包括 以預定速率長期和/或定時、脈沖輸送給藥的長效注射劑、滲式栗、丸劑、透皮貼片等。于特 定具體實施方案中，組合物為適用于以精準劑量單一給藥的單位劑型。
[0021] 本文所述的化學實體可單獨給藥或更典型地與常規(guī)醫(yī)藥載體、賦形劑等（例如， 甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬酯酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、葡萄糖、明 膠、蔗糖、碳酸鎂等）組合給藥。如果需要，則藥物組合物亦可含少量不具毒性的輔助物 質例如潤濕劑、乳化劑、增溶劑、pH緩沖劑等（例如，乙酸鈉、檸檬酸鈉、環(huán)糊精衍生物、 山梨聚糖單月桂酸酯、三乙醇胺乙酸酯、三乙醇胺油酸酯等）。通常，視意指給藥方式而 定，藥物組合物含有約〇. 005重量％至95重量％的化學實體，于特定具體實施方案中， 約0. 5重量％至50重量％的化學實體。制備此等劑型的確實方法為已知或為本領域技 術人員所顯見，例如參見 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania。
[0022] 此外，本文所述的可與包括醫(yī)藥劑、制藥劑、佐劑等藥物組合物一起給藥。適當?shù)?附加活性劑例如包括：利用向下調控對心臟的神經(jīng)激素刺激阻止心力衰竭進展及試圖預防 心臟重塑的治療劑（例如，ACE抑制劑或β-封阻劑）；利用刺激心臟收縮改進心臟功能的 治療劑[例如，陽性心肌收縮力增強劑如β-腎上腺素能促效劑多巴酚丁胺或磷酸二酯酶 抑制劑米利酮];及減少心臟前負荷量的治療劑[例如，利尿劑如呋塞米]。其他適當?shù)母?加活劑包括血管擴張劑、毛地黃毒苷、抗凝血劑、鹽皮質激素拮抗劑、血管收張素受體阻斷 劑、硝基甘油、其他心肌收縮力增強劑、及用于治療心力衰竭的任何其他治療劑。