一種曼西醇類化合物的提取分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及天然藥物化學領(lǐng)域，特別是一種曼西醇類化合物的提取分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大戟屬植物作為一種具有悠久用藥歷史的傳統(tǒng)藥物，其用藥經(jīng)驗在世界各地均有 報道，在我國《中藥大辭典》和《中草藥匯編》（1987年版)分別記載有32種和35種入藥。大戟 屬藥用植物常用作通便、利尿藥物，用于治療水腫、結(jié)核、牛皮癬、疥瘡、無名腫毒等疾患。研 究表明，大戟屬植物化學成分十分復雜，主要含有二萜酯類，三萜類、留醇類、黃酮類和酚性 成分。該屬植物所具有的多種活性，如抗腫瘤、抗病毒、皮膚刺激以及致癌活性等，引起了廣 泛的學術(shù)關(guān)注。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種曼西醇類化合物的提取分離方法，為研究大戟屬藥用 植物的藥用價值提供參考。
[0004] 為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，達到上述技術(shù)效果，本發(fā)明公開了一種曼西醇類化合物的 提取分離方法，提取分離方法包括了：
[0005] (1)蒿狀大戟樣品粉碎后以濃度為70%的丙酮-水浸泡提取，提取液減壓濃縮除去 丙酮；
[0006] (2)濃縮液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮得浸膏；
[0007] (3)石油醚浸膏用硅膠柱層析初分，然后采用中壓和高效液相色譜法進一步分離， 即得到所需的化合物；
[0008] 曼西醇類化合物的提取分離詳細步驟為：
[0009] (1)以蒿狀大戟地上部分粉碎至20-40目，以濃度為70%的丙酮-水為溶劑，室溫浸 泡提取3次，每次2天，合并提取液，減壓濃縮去除丙酮；
[0010] (2)濃縮液依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取各3次，去除溶劑得浸 膏；
[0011] (3)石油醚浸膏用60-100目的硅膠干法裝柱進行硅膠柱層析粗分，用體積配比為 1:0-1:1的石油醚-丙酮溶液進行梯度洗脫，收集各個部分洗脫液并濃縮;洗脫液的4:1組分 經(jīng)中壓液相色譜MPLC(MCI gel CHP 20P，90%甲醇）得組分Fr.A，F(xiàn)r.A再經(jīng)凝膠色譜 Sephadex LH-20,氯仿-甲醇1:1洗脫，后經(jīng)半制備高效液相色譜法分離純化即得到所需的 化合物。
[0012] 其中，石油醚-丙酮梯度洗脫溶液體積配比分別為1:0、20:1、9:1、4:1、2:1、1:1。 [0013]優(yōu)選的，高效液相色譜法分離純化是采用l〇mm X 250mm的C18色譜柱，流速為 3.6mL/min，流動相為72 %的甲醇，保留時間tR = 30.3分鐘。
[0014] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0015] 1.本發(fā)明通過嚴謹?shù)目茖W提取分離純化工藝，得到的化合物經(jīng)過多種結(jié)構(gòu)表征， 可以確認為14-去羰基_2α，3β，5α，7β，10-五乙酰氧基-14α-苯甲?；?15β-煙?；?10，18- 二氫曼西醇。
[0016] 2.分離得到的化合物細胞毒活性實驗表明，該化合物對人白血病細胞(HL-60)和 人肝癌細胞(SMMC-7721)具有較好的細胞毒活性，IC5Q值分別為3.80μΜ和4.33μΜ，對于其它 測定的細胞株也顯示出一定的細胞毒活性，為后續(xù)應(yīng)用開發(fā)奠定了科學依據(jù)。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明的化合物結(jié)構(gòu)示意圖。
[0018] 圖2為本發(fā)明的化合物高分辨質(zhì)譜。
[0019] 圖3為本發(fā)明的化合物1H NMR譜圖。
[0020] 圖4為本發(fā)明的化合物13C NMR譜圖。
【具體實施方式】
[0021]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對 本發(fā)明進行進一步詳細說明。
[0022] 實施例1
[0023]本發(fā)明公開了一種曼西醇類化合物的提取分離方法，包括：
[0024] (1)以蒿狀大戟地上部分粉碎至20-40目，以濃度為70%的丙酮-水為溶劑，室溫浸 泡提取3次，每次2天，合并提取液，減壓濃縮去除丙酮；
[0025] (2)濃縮液依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取各3次，去除溶劑得浸 膏；
[0026] (3)石油醚浸膏用60-100目的硅膠干法裝柱進行硅膠柱層析粗分，分別用體積配 比為1:0、20:1、9:1、4:1、2:1、1:1的石油醚-丙酮溶液進行梯度洗脫，收集各個部分洗脫液 并濃縮;洗脫液的4:1組分經(jīng)中壓液相色譜MPLC(MCI gel CHP 20P，90%甲醇)得組分Fr.A， Fr.A再經(jīng)凝膠色譜Sephadex LH-20,氯仿-甲醇1:1洗脫，后經(jīng)半制備高效液相色譜法分離 純化，采用1 〇mm X 250mm的C18色譜柱，流速為3.6mL/min，流動相為72 %的甲醇，保留時間tR =30.3分鐘即得到所需的化合物。
[0027] 實施例2
[0028]實驗?zāi)康募胺椒?對所提取的化合物進行表征，表征內(nèi)容如下：旋光度、紫外光譜 (甲醇溶劑）、紅外光譜(溴化鉀壓片）、高分辨質(zhì)譜、1D和2D核磁共振譜，所采用表征方法均 按照標準操作，無任何修改。
[0029]實驗結(jié)果：
[0030]旋光[€1]23.20-119.5(。0.18，甲醇），紫外（甲醇）人臆（1叩8):224(3.55)和201 (3.47)nm，高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MS m/z 842.2994[M+Na] +，計算值，842.3000，揭示分子式為 C43H49NO15,紅外光譜IR(KBr壓片）：3441，1740,1631，1371，1243cm-VH NMR譜顯示（表1)9個 甲基單峰δΗ 2·31，2· 13，1 ·99，1 ·80，1 ·76，1 ·65，1 ·56，1 ·37和 1 ·26，其中5個為乙酰基所有， 4個連在季碳上。同時咕NMR譜還顯示了 1個單取代苯RH8.11(2H，d，J = 7.4Hz)，7.60(lH，t， 了 = 7.4他），7.47(2!1，^ = 7.4抱）]和1個單取代啦啶[5[19.24(1!1，8)，8.80(1!1，1^8)，8.32 (lH，d, J = 7.4Hz)，7.46(lH，overlapped)]。此外，還觀察到2個鄰位稀碳質(zhì)子[δΗ6· 17(1H, m)，5.92(lH，dd，J= 10.0,5 ·7Ηζ)]和1個氧化亞甲基[δΗ4·20(1Η,d，J = 8.8Hz)，3·55(1Η， dd，J = 8 · 8，1 · 4Hz) ]。13(：匪R譜顯示有7個羰基信號^170 · 8，170 · 5，169 · 6，169 · 5，168 · 7， 165.9和164.9。因此，化合物1可能是1個高度氧化的四環(huán)二萜，具有5個乙酰氧基，1個苯甲 ?；?個煙酰基。比較化合物1和已知化合物euphorprolitherin B(分離自Euphorbia p r ο 1 i f e r a的曼西醇）的N M R譜數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，它們結(jié)構(gòu)非常相似，不同處在于 euphorprolither in B中C-3位的丙酰氧基和C-15的乙酰氧基分別被化合物1中的1個乙酰 氧基和1個煙酰氧基所取代。HMBC譜中觀察到的甲基δ Η2.31(3Η，8)和氧化次甲基信號δΗ5.66 (1!1，(1，1 = 3.7他，!1-3)與酯羰基心168.7的相關(guān)確認了上述推斷。同理，其它取代基的位置 也根據(jù)2D NMR譜(4-? C0SY，HSQC和HMBC)進行了指認(見圖1)。
[0031 ]化合物1的相對構(gòu)型由R0ESY譜（圖1)結(jié)合其生源途徑加以確認。文獻報道的天然 產(chǎn)物曼西醇二萜，其5/7/6稠合形成的三環(huán)為反式稠合，且H-4和H2-17為α-取向，16位甲基， H-12，C-11側(cè)鏈和C-15酰氧基均為β-取向[2]。此外，在R0ESY譜中可觀察到Η-4α與Η-3，Η-7 與Η 2-17的相關(guān)，揭示Η-3和Η-7為α-取向，觀察到的Η-12β與Η-5，Η-12與Η-14，Η-18與20位甲 基的相關(guān)說明Η-5，Η_14和20為甲基為β-取向。最終，化合物1確定為：14_去羰基_2α，3β，5α， 7β，10-五乙酰氧基-14α-苯甲酰基-15β_煙?；?10,18-二氫曼西醇。
[0032]表1.化合物的1Η(600ΜΗζ)和 13C(150MHz)NMR 數(shù)據(jù)(CDChJppm)
[0035] 實施例3
[0036] 實驗?zāi)康募胺椒?評估提取分離得到的化合物的細胞毒性和細胞增殖情況影響， 分別采用MTT法和SRB法進行分析評估，分別對人白血病細胞(HL-60)、人肝癌細胞（SMMC-7721)、人肺癌細胞(A549)、人乳腺癌細胞(MCF-7)和人結(jié)腸癌細胞（SW480)進行細胞毒實 驗，具體實驗方法為參照標準實驗方法進行，無其他修改。
[0037] 實驗結(jié)果：
[0038] 化合物對人白血病細胞（HL-60)的IC5〇值為3.80μΜ、人肝癌細胞（SMMC-7721)的 IC50值為4.33μΜ、人肺癌細胞(Α549)的IC5Q值為10.27μΜ、人乳腺癌細胞(MCF-7)的IC 5Q值為 14.67μΜ、人結(jié)腸癌細胞(SW480)的IC5Q值為10.96μΜ?；衔飳θ税籽〖毎?HL-60)和人肝 癌細胞(SMMC-7721)有較好的細胞毒活性，對其它測試細胞也有一定活性。
[0039]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換， 都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種曼西醇類化合物的提取分離方法，其特征在于，所述的提取分離方法包括了： (1) 蒿狀大戟樣品粉碎后以濃度為70%的丙酮-水浸泡提取，提取液減壓濃縮除去丙 酮； (2) 濃縮液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮得浸膏； (3) 石油醚浸膏用硅膠柱層析初分，然后采用中壓和高效液相色譜法進一步分離，即得 到所需的化合物； 所述的曼西醇類化合物的提取分離詳細步驟為： (1) 以蒿狀大戟地上部分粉碎至20-40目，以濃度為70%的丙酮-水為溶劑，室溫浸泡提 取3次，每次2天，合并提取液，減壓濃縮去除丙酮； (2) 濃縮液依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取各3次，去除溶劑得浸膏； (3) 石油醚浸膏用60-100目的硅膠干法裝柱進行硅膠柱層析粗分，用體積配比為1:0-?: 1 的石油醚-丙酮溶液進行梯度洗脫 ，收集各個部分洗脫液并濃縮; 洗脫液的4:1 組分經(jīng)中 壓液相色譜MPLC(MCIgelCHP20Ρ，90%甲醇）得組分Fr.A，F(xiàn)r.A再經(jīng)凝膠色譜Sephadex LH-20,氯仿-甲醇1:1洗脫，后經(jīng)半制備高效液相色譜法分離純化即得到所需的化合物。2. 如權(quán)利要求1所述的一種曼西醇類化合物的提取分離方法，其特征在于:所述的石油 醚-丙酮梯度洗脫溶液體積配比分別為1: 〇、20:1、9:1、4:1、2:1、1:1。3. 如權(quán)利要求1或2所述的一種曼西醇類化合物的提取分離方法，其特征在于:所述的 高效液相色譜法分離純化是采用l〇mmX250mm的C18色譜柱，流速為3.6mL/min，流動相為 7 2 %的甲醇，保留時間tR = 3 0.3分鐘。
【專利摘要】本發(fā)明涉及天然藥物化學領(lǐng)域，公開了一種曼西醇類化合物的提取分離方法，通過嚴謹科學的提取分離純化工藝，從蒿狀大戟中分離得到；化合物經(jīng)過多種結(jié)構(gòu)表征，確認為14-去羰基-2α,3β,5α,7β,10-五乙酰氧基-14α-苯甲?；?15β-煙?；?10,18-二氫曼西醇；分離得到的化合物細胞毒活性實驗表明，該化合物對人白血病細胞(HL-60)和人肝癌細胞(SMMC-7721)具有較好的細胞毒活性，IC50值分別為3.80μM和4.33μM，對于其它測定的細胞株也顯示出一定的細胞毒活性。為后續(xù)開發(fā)應(yīng)用奠定了科學依據(jù)。
【IPC分類】C07D405/12, A61P35/02
【公開號】CN105481840
【申請?zhí)枴緾N201510881868
【發(fā)明人】趙勇, 王莉, 遲宇前, 趙炎, 臧貞
【申請人】云南師范大學
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2015年12月7日