法國(guó)梧桐花粉變應(yīng)原Pla a 3及其單克隆抗體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種法國(guó)梧桐花粉變應(yīng)原Pla a 3及其單克 隆抗體。
【背景技術(shù)】
[0002] 梧桐樹(shù)是市面上大量種植的綠化植物，春季開(kāi)花，花期4~5月，其花粉可引起變應(yīng) 性皮膚病和過(guò)敏性哮喘等疾病。
[0003] 花粉病大多與周?chē)h(huán)境中過(guò)敏源的消長(zhǎng)有關(guān)，是一種季節(jié)性疾病，以春夏最易發(fā) 病，在我國(guó)北方，每年花粉病發(fā)病的兩個(gè)高峰期主要是4~5月和8~9月 [1]。我國(guó)北方地區(qū)風(fēng) 大干燥，南方濕潤(rùn)多雨，因此花粉病多以北方為主，南方次之?？梢?jiàn)，花粉病與氣候條件有 關(guān)，因此，對(duì)花粉病患者來(lái)說(shuō)，了解影響空氣中花粉播散規(guī)律的氣象條件是十分重要的 [2]。
[0004] 有兩類(lèi)病人患病率較高：一是有遺傳性過(guò)敏體質(zhì)的人。二是反復(fù)多次暴露于外界 過(guò)敏源的人。這兩類(lèi)病人通常具有過(guò)敏體質(zhì)，即對(duì)外界抗原較易產(chǎn)生比正常人多的特殊抗 體IgE，有一定的遺傳性和家族性。所以，這兩類(lèi)病人較易同時(shí)或先后患濕疹皮炎，藥物過(guò)敏 和支氣管哮喘等。
[0005] 梧桐花粉是春季重要的致敏花粉，近年來(lái)將其編入春季花粉致敏組，常規(guī)用于脫 敏治療。但對(duì)其過(guò)敏原卻知之甚少?，F(xiàn)已經(jīng)有報(bào)道采用了ELISA與SDS-PAGE的方法，對(duì)梧桐 花粉過(guò)敏原Pla a 1以及Pla a 2的純化，克隆等作出了研究[3]，用ELISA方法分別檢測(cè)兩種 花粉過(guò)敏原與梧桐花粉過(guò)敏的患者的血清中IgE反應(yīng)性，結(jié)果顯示兩種重組蛋白均有免疫 學(xué)活性，與血清的反應(yīng)性好 [4]。另外，植物花粉中變應(yīng)原的提取、純化和性質(zhì)研究已有很多 報(bào)道。包括從柳杉中提取的過(guò)敏原Cry j 2[5];從油菜中提取的分子量為43KDa的過(guò)敏原[6]; 從西紅柿中提取的分子量為46KDa的過(guò)敏原 [7];這些花粉過(guò)敏原的文章僅是對(duì)相應(yīng)過(guò)敏原 基因進(jìn)行了克隆，構(gòu)建原核表達(dá)載體，進(jìn)行原核表達(dá)和提純以及活性鑒定。
[0006] 免疫印跡，是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該 法是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫 印跡具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的 一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。結(jié)合化 學(xué)發(fā)光檢測(cè)，可以同時(shí)比較多個(gè)樣品同種蛋白的表達(dá)量差異。
[0007] 前期對(duì)梧桐花粉變應(yīng)原已有研究。李雅莉，孫秀珍等采用SDS-PAGE、免疫印跡等方 法分析梧桐花粉變應(yīng)原，發(fā)現(xiàn)法國(guó)梧桐花粉變應(yīng)原含6種主要蛋白成分，分子質(zhì)量在22~ 71kDa間的蛋白質(zhì)含量高，為主要致敏組分;分子質(zhì)量在14~16kDa間的之蛋白質(zhì)是次要致 敏組分。其中有4條蛋白帶能與梧桐花粉特異性IgE結(jié)合，其分子質(zhì)量為50、39、22、16kDa [8]。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的之一在于提供法國(guó)梧桐花粉變應(yīng)原Pla a 3,更進(jìn)一步，本發(fā)明的目 的是提供法國(guó)梧桐花粉變應(yīng)原Pla a 3和單克隆抗體，以及單克隆抗體的制備方法。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:法國(guó)梧桐花粉變應(yīng)原Pla a 3,所 述變應(yīng)原Pla a 3是從梧桐花粉中分離純化得到，通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定其融合蛋白SUMO-Pla a 3表觀分子量為28kDa。
[0010] 根據(jù)權(quán)利要求1所述的變應(yīng)原Pla a 3,所述變應(yīng)原Pla a 3的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 變應(yīng)原Pla a 3的DNA，所述DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0012] 法國(guó)梧桐花粉變應(yīng)原Pla a 3的單克隆抗體，所述單克隆抗體是以梧桐花粉中Pla a 3為過(guò)敏源制備獲得，具有與法國(guó)梧桐花粉變應(yīng)原Pla a 3特異性結(jié)合的能力。
[0013] 法國(guó)梧桐花粉變應(yīng)原Pla a 3的單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟： (1) 將目的基因 Pla a 3連接到載體pSUMO-Mut的Stu I和Xho I位點(diǎn)之間，獲得的重組 質(zhì)粒pSUM〇-Mut-Pla a 3轉(zhuǎn)入Arctic Express表達(dá)菌株中，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白； (2) 將獲得的重組蛋白超聲破碎并低溫離心，溶液上清通過(guò)鎳柱親和層析，洗脫得到純 化重組蛋白； (3) 用純化后的重組蛋白免疫Balb/c小鼠，多次免疫，尾靜脈采血測(cè)定血清效價(jià)后，取 小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，并用HAT篩選得到穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株； (4) 將雜交瘤細(xì)胞株注射到液體石蠟預(yù)處理的小鼠腹腔，隔周取腹水，50%飽和硫酸銨 沉淀法和Protein G親和純化單抗，得到單克隆抗體。
[0014] 所述步驟1中的表達(dá)誘導(dǎo)溫度優(yōu)選為11°C，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速為200rpm。誘導(dǎo)的IPTG濃度為 0.5mmol/L〇
[0015] 本發(fā)明的蛋白Pla a 3是從梧桐花粉中分離純化得到，通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定其融合 蛋白SUMO-Pla a 3分子量為28kDa。由此值得的單克隆抗體的特異性在于能夠與法國(guó)梧桐 花粉變應(yīng)原Pla a 3特異性結(jié)合，為梧桐花粉引起的變應(yīng)性皮膚病及哮喘等I型變態(tài)反應(yīng)性 疾病的診斷與治療起到重要作用。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖 1 是實(shí)施例pSUM〇-Mut-Pla a 3質(zhì)粒酶切圖，Marker:100,250,500,750，1000， 1500,2000,3000,5000;基因名稱(chēng):Pla a 3;酶切鑒定:BamH 1;1是酶切后質(zhì)粒;2是酶切前 質(zhì)粒;0D260/0D280:1.87。
[0017] 圖2是實(shí)施例pSUM〇-Mut-Pla a 3載體構(gòu)建圖譜。
[0018] 圖3是實(shí)施例融合蛋白pSUM〇-Mut-Pla a 3誘導(dǎo)表達(dá)鑒定的SDS-PAGE結(jié)果，其中1 是未經(jīng)誘導(dǎo)的pla a 3蛋白免疫印跡條帶，2和3都是經(jīng)誘導(dǎo)后蛋白，4是蛋白經(jīng)加入0.5mM IPTG，在11度的溫度下誘導(dǎo)后的上清，5是蛋白經(jīng)加入0.5mM IPTG，在11度的溫度下誘導(dǎo)后 的沉淀，Μ為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，由上而下分別為100.0，65.0，50.0，40.0，30.0，25.0， 20.0kDa； 圖4是實(shí)施例融合蛋白pSUM〇-Mut-Pla a 3分離純化的SDS-PAGE結(jié)果，其中1是未經(jīng)誘 導(dǎo)的pla a 3蛋白，2是10mM咪唑純化后的洗脫液，3是250mM咪唑純化后的目的蛋白，Μ為蛋 白分子量標(biāo)準(zhǔn)，由上而下分別為 l〇〇.〇,65.0,50.0,40.0,30.0,25.0,20.0kDa;
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0020] 梧桐花粉變應(yīng)原Pla a 3的確定： pSUMO-Mut-Pla a 3質(zhì)粒構(gòu)建： 將人工合成目的基因 Plaa3全序列(SEQIDN0.2)，并連接到載體pSUM0-Mut的StuI 和Xho I位點(diǎn)之間，將獲得的重組質(zhì)粒pSUMO-Mut-Pla a 3轉(zhuǎn)入Arctic Express表達(dá)菌株 中。挑取陽(yáng)性克隆子測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如下所示，單劃線區(qū)域?yàn)镻la a 3基因區(qū)域。
[0021] TATTTGAGGCTCACCGCGAACAGATTGGAGGTGCCATAACATGTGGTACGGTGGTGACCAGGCTGACCCCATGCCTC ACCTTCTTGCGCTCTGGTGGGGCTGTAGCGCCCGCTTGCTGCAACGGCGTGAAGGCACTCAACAACGACGCTAAAAC CACCCCAGACCGTCAGGCCGCTTGTGGATGTTTGAAGACTGCCTCCACCTCCATCTCCGGGATCCAGCTCGGTAACG CTGCCTCGCTTGCCGGCAAATGTGGTGTTAATCTCCCTTACAAGATCAGCCCCACCATTGACTGCTCCAAGGTGAAG TGACTCGAGCACCTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAAT AACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATTG GCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTT GCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGC TCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTT AGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGAC GGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACT 翻譯后融合蛋白序列（SEQ ID N0.3)如下:單劃線區(qū)域?yàn)槟康牡鞍譖la a 3，Pla a 3蛋 白理論分子量約為9kDa，融合蛋白SUMO-Pla a 3理論分子量約為28kDa左右。
[0022] MNWSHPQFEKSSGSSGGHHHHHHGGSGGSGSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRL MEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGAITCGTVVTRLTPCLTFLRSGGAVAPA CCNGVKALNNDAKTTPDRQAACGCLKTASTSISGIQLGNAASLAGKCGVNLPYKISPTIDCSKVK. 將pSUM〇-Mut-Pla a 3載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Arctic ExpressTM(DE3):將質(zhì)粒加入到 100yL Arctic ExpressTM(DE3)感受態(tài)細(xì)菌中，置冰上20min;42°C熱激90sec，迅速置冰中 5min;加入600yL，37°C預(yù)熱的LB培養(yǎng)液;37°C，220rpm振搖lh，離心后全部涂布于含50yg/mL Kan的LB平板，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。
[0023] IPTG誘導(dǎo)pSUM〇-Mut-pla a 3載體融合蛋白的表達(dá):挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆接 種于含50yg/mL Kan的3mL LB培養(yǎng)液的試管中，37°C220rpm振搖過(guò)夜;次日按1:100接種于 50yg/mL Kan的30mL LB培養(yǎng)液中，37°C220rpm振搖至菌體0D600為0.4(約2h);取出lmL培養(yǎng) 物，10000g室溫離心2min，棄上清，用100yL 1 X上樣緩沖液重懸菌體沉淀；向剩余的培養(yǎng)物 中加入IPTG至終濃度為0.5mM 1 l°C220rpm分別振搖8h，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。
[0024] 變應(yīng)原Pla a 3的確定（采用免疫印跡方法）：取出lmL培養(yǎng)物，12000g室溫離心 2min，棄上清，用100yL 1 X上樣緩沖液重懸菌體沉淀。應(yīng)用12 %分離膠，5 %濃縮膠對(duì)樣品 進(jìn)行分離。起始電壓70V，待溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠后將電壓升至120V，恒壓電泳，直至溴酚 藍(lán)前沿到達(dá)凝膠下邊界，停止電泳。取下凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。恒流轉(zhuǎn)引60min，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。將PVDF膜放入盛有封閉液的平皿中，封閉3h。將封閉后的PVDF膜放在一抗中，4度過(guò) 夜。次日將條帶用TBST進(jìn)行洗滌3*10min。之后放入到鼠抗(二抗）中，室溫置搖床上2h，結(jié)束 后用TBST進(jìn)行洗滌3*5min，進(jìn)行底物顯色，待蛋白條帶顯色清晰，終止反應(yīng)。免疫印跡的結(jié) 果如圖3所示。圖中1是未經(jīng)誘導(dǎo)的pla a 3蛋白免疫印跡條帶，2和3都是經(jīng)誘導(dǎo)后蛋白，4是 蛋白經(jīng)加入〇.5mM IPTG，在11度的溫度下誘導(dǎo)后的上清，5是蛋白經(jīng)加入0.5mM IPTG，在11 度的溫度下誘導(dǎo)后的沉淀，Μ為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。從圖結(jié)果可看到28KD位置蛋白為主要致敏 蛋白。
[0025] 變應(yīng)原Pla a 3的分離純化： 將誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)菌體沉淀用20mL抽提液Ni-IDA Binding-Buffer重懸后，超聲破碎 (功率400W，工作4sec，間歇8sec，共20min)，4°C10000g離心20min，取上清，以0 · 5mL/min流 速上樣至Ni-IDA Binding-Buffer預(yù)平衡的Ni-IDA-Sepha