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水稻水通道蛋白OsPIP1;1及其基因的新應(yīng)用

文檔序號:9721542閱讀:1186來源:國知局
水稻水通道蛋白OsPIP1;1及其基因的新應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域,具體涉及水稻水通道蛋白〇sPIPl;l@ryza ytiva £lasma membrane intrinsic [rotein 1;1)及其編碼基因和在調(diào)控水稻和酵母錦 積累方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是我國重要的糧食作物,也是重金屬鎘(Cd)富集農(nóng)作物之一。近年來,我國土 壤污染狀況十分嚴(yán)重,其中以土壤鎘污染最為突出。土壤中的鎘被農(nóng)作物吸收,并通過食物 鏈富集于人體的腎臟、肝臟等器官造成毒害,并引起人體內(nèi)骨質(zhì)鈣流失,嚴(yán)重危害人體健 康。
[0003] 水稻是一種重金屬鎘富集的農(nóng)作物。2014年4月,國土資源部和環(huán)境保護(hù)部公布數(shù) 據(jù)表明,我國土地的重金屬污染十分嚴(yán)重,按照點位超標(biāo)率計算,我國土壤中鎘超標(biāo)的土地 已達(dá)我國國土總面積的7%。按照污染發(fā)生的地區(qū)來看,重金屬污染則主要分布于我國的華 中華南地區(qū)、泛珠三角地區(qū)、長三角地區(qū)及東北地區(qū),這些地區(qū)均為我國水稻的主要產(chǎn)區(qū), 嚴(yán)重影響我國的水稻糧食安全。近年來,由媒體報道的稻米鎘超標(biāo)事件層出不窮,引起了民 眾巨大的恐慌??寺『头蛛x水稻體內(nèi)的鎘脅迫應(yīng)答和解毒基因,具有重要的意義和潛在的 應(yīng)用價值。〇sPIPl;l是水稻中的水通道蛋白之一。水通道蛋白首次在人類紅細(xì)胞中得以鑒 定,主要介導(dǎo)水分子的跨膜轉(zhuǎn)運,該項發(fā)現(xiàn)于2003年獲得了諾貝爾化學(xué)獎。植物水通道蛋白 (Aquaporin,AQP)是位于細(xì)胞質(zhì)膜和內(nèi)膜上的水分子通道蛋白(water channel protein), 同時也可跨膜運輸甘油、尿素、C02、氨氣、H202等小分子和硅、砷、硼、硒、銻等類金屬。植物水 通道蛋白參與應(yīng)答包括鹽脅迫、干旱和冷脅迫等多種非生物脅迫,這類脅迫應(yīng)答主要與維 持細(xì)胞內(nèi)水平衡相關(guān);近期的研究發(fā)現(xiàn),部分植物水通道蛋白成員在類金屬的跨膜轉(zhuǎn)運和 維持細(xì)胞內(nèi)類金屬內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。
[0004] 在本發(fā)明中,我們描述了水稻水通道蛋白0sPIPl;l基因的表達(dá)能夠影響重金屬鎘 在生物體內(nèi)的積累,提供了將該基因應(yīng)用于重要糧食作物一一水稻的低鎘遺傳育種技術(shù), 本發(fā)明也可應(yīng)用于工程菌一一釀酒酵母的低鎘遺傳改造。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種水稻水通道蛋白OsPIPl; 1及其編碼基因 OsPIPl; 1的新應(yīng)用。
[0006] 實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0007] 氨基酸序列如SEQ ID N0.2的水稻水通道蛋白OsPIPl ;1和/或OsPIPl ;1基因在水 稻中降低重金屬鎘積累的應(yīng)用,所述OsPIP1; 1基因的cDNA為如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸 序列,或為與SEQ ID NO. 1互補配對的核苷酸序列,或為編碼序列氨基酸序列如SEQ ID NO. 2的核苷酸序列。
[0008] 本發(fā)明的水稻胰蛋白酶抑制劑OsPIPl ;1,其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示,其編 碼基因 OsPIPl;l的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。應(yīng)當(dāng)理解,考慮到密碼子的簡并性,在 不改變氨基酸序列的前提下,對上述編碼基因的核苷酸序列進(jìn)行修改,也屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍內(nèi)。
[0009] 本發(fā)明的另一的是提供一種RNAi片段的表達(dá)載體,該表達(dá)載體克隆有上述針對水 稻水通道蛋白基因 OsP IP 1; 1的RNAi片段。使用該RNAi載體在水稻體內(nèi)轉(zhuǎn)基因,可用于培育 水稻低鎘品種。
[0010] 實現(xiàn)該目的的技術(shù)方案如下。
[0011]插入有核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示的核苷酸片段的RNAi表達(dá)載體。
[0012] 優(yōu)選地,所述表達(dá)載體為PTCK303。
[0013] 本發(fā)明的另一目的是提供上述RNAi表達(dá)載體的制備方法。
[0014] 實現(xiàn)該目的的技術(shù)方案如下。
[0015] RNAi表達(dá)載體的制備方法,包括有以下步驟:
[0016] (l)將核苷酸序列如SEQIDN0.3所示的核苷酸片段連接于pGEMT-Vector上形成 pGEMT-PIPRI;
[0017] (2)用SacI和Spel雙酶切pGEM T-PIPRI,回收得到片段F1,同時用SacI和Spel雙酶 切載體PTCK303,將回收后的F1片段與經(jīng)SacI和Spel雙酶切處理后的pTCK303載體連接,形 成PTCK303-PIPRI-F1;
[0018] (3)用BamHI和ΚρηΙ雙酶切pGEM T-PIPRI并回收得到片段F2,然后將片段F2與 BamHI和ΚρηΙ雙酶切處理后pTCK303-PIPRI-Fl載體連接,即得。
[0019] 優(yōu)選地,核苷酸序列如SEQ ID Ν0.3所示的核苷酸片段,通過以下方法得到:以水 稻基因組DNA為模板,以SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5為引物,進(jìn)行擴(kuò)增,回收擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0020] 本發(fā)明的另一目的是提供上述RNAi表達(dá)載體的應(yīng)用。
[0021] 實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0022] 上述RNAi表達(dá)載體在水稻中降低重金屬鎘積累的應(yīng)用。其可用于培育水稻低鎘品 種。
[0023] 本發(fā)明的另一目的是提供一種降低水稻中重金屬鎘積累的生物制劑。
[0024] 實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0025] -種降低水稻中重金屬鎘積累的生物制劑,其活性成份為上述的RNAi表達(dá)載體, 或含有0sPIPl;l基因。
[0026] 上述的0sPIPl;l基因、水稻超表達(dá)載體和/或RNAi表達(dá)載體,可以制備成生物制 劑,用于降低水稻中重金屬鎘積累,用于水稻的低鎘遺傳育種。
[0027]本發(fā)明的另一目的是提供一種降低水稻中重金屬鎘積累的方法。
[0028]實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0029] 一種降低水稻中重金屬鎘積累的方法,該方法步驟中包括調(diào)控0sPIPl;l基因的表 達(dá),所述0sPIPl;l基因的cDNA為如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列,或為與SEQ ID N0.1互 補配對的核苷酸序列,或為編碼序列氨基酸序列如SEQ ID N0.2的核苷酸序列。
[0030]本發(fā)明的有益效果如下:
[0031 ] 在本發(fā)明中,我們通過對篩選文庫獲得的OsPIPl ; l@ryza ptiva Elasma membrane intrinsic protein 1;1)基因的進(jìn)一步研究,發(fā)現(xiàn)該基因具有以下應(yīng)用:(1)該 基因在釀酒酵母中的超量表達(dá)能夠降低酵母細(xì)胞對重金屬鎘的積累,促進(jìn)酵母體內(nèi)鎘的外 排;(2)通過將OsPIPl; 1基因在水稻中RNAi,降低轉(zhuǎn)基因水稻株系中OsPIPl; 1基因的表達(dá) 量,可以影響轉(zhuǎn)基因水稻種子中鎘含量,得到低鎘富集的轉(zhuǎn)基因水稻品系。該基因可應(yīng)用于 工程菌及水稻針對體內(nèi)鎘含量改變的遺傳工程育種,也可應(yīng)用于其他植物的針對體內(nèi)鎘富 集的遺傳工程育種。
【附圖說明】
[0032] 圖1示構(gòu)建完成的釀酒酵母重組表達(dá)載體OsPIPl; l-pYES2示意圖。
[0033]圖2示轉(zhuǎn)化OsPIPl; l-pYES2的轉(zhuǎn)基因酵母在含鎘培養(yǎng)基中生長后鎘積累降低。 [0034] 圖3示構(gòu)建完成的水稻轉(zhuǎn)基因 RNA干涉載體OsPIPl; l-pTCK303示意圖。
[0035] 圖4示水稻OsPIPl; 1轉(zhuǎn)基因 RNAi植株的qRT-PCR檢測。
[0036] 圖5示野生型水稻種子和OsPIPl; 1轉(zhuǎn)基因 RNAi水稻種子中鎘含量的比較。
【具體實施方式】
[0037] 本發(fā)明主要闡述OsPIPl ;1基因在調(diào)控鎘積累生物工程方面的應(yīng)用。本發(fā)明以水稻 日本晴品種幼苗葉片為材料提取RNA,并將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板,設(shè)計引物 PIPF: 5 ' -ATGGAGGGGAAGGAGGAGGAC-3 ' 和PIPR: 5 ' -TTAAGACCTGCTCTTGAATGG-3 ',并采用高保 真的Taq酶擴(kuò)增OsPIPl; 1基因的cDNA閱讀框全長,回收得到的片段連接于pGEM T-vector, 形成OsPIPl ;l-pGEM T重組質(zhì)粒,并測序。OsPIPl ;1基因在水稻基因組數(shù)據(jù)庫(MSU Rice Genome Annotation Project Database and Resource,http:// rice .plantbiology .msu · edu/index · shtml)中的編號為L0C_0s02g44630,命名為OsPIPl; 1 (Qryza ytiva Elasma membrane Intrinsic Er〇tein 1; 1)。該基因編碼一個包含87〇個 豐i苷酸的開放閱讀框,其序列如SEQ ID NO. 1所示。其編碼蛋白具有289個氨基酸殘基,其序 列如SEQ ID N0.2所示。
[0038] 在本發(fā)明中,通過構(gòu)建酵母轉(zhuǎn)基因超表達(dá)載體OsPIPl; l-pYES2,并將該載體轉(zhuǎn)化 釀酒酵母,通過該基因在酵母體內(nèi)的誘導(dǎo)表達(dá),可以降低酵母對重金屬鎘的積累。用于構(gòu)建 酵母表達(dá)載體的引物為OsPIPl; 1YEF: 5 ' -TACCGAGCTCGGATCCATGGAGGGGAAGGAGGAGGAC-3 ' 和 OsPIPl; 1YER:5'-TAGATGCATGCTCGAGTTAAGACCTGCTCTTGAATGG_3'。通過該對引物以重組質(zhì) 粒OsPIPl; 1-pGEM T為模板,采用高保真Taq酶PCR擴(kuò)增OsPIPl; 1基因的cDNA閱讀框片段,回 收的DNA片段插入酵母表達(dá)載體pYES2的BamHI和Xhol酶切位點之間。經(jīng)測序驗證正確后,即 形成OsPIPl; 1基因在酵母中的轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)超表達(dá)載體OsPIPl; 1-p YES2(如圖1所示)。將該 重組載體OsPIPl; 1-PYES2采用醋酸鋰的方法轉(zhuǎn)化進(jìn)入釀酒酵母中,采用誘導(dǎo)的極限培養(yǎng)基 (添加半乳糖)培養(yǎng)酵母轉(zhuǎn)化子克隆,以轉(zhuǎn)化PYES2空載體的酵母菌株為對照,30°C培養(yǎng)酵母 至0D600為1.5-2,然后在培養(yǎng)基中添加1(^1和3(^1的0(1(:1 2,重新培養(yǎng)24小時,離心收獲酵 母細(xì)胞,用雙蒸水清洗3遍,65°C干燥3-5天,干燥的酵母塊將微波消解后,采用火焰法原子 吸收光譜測定酵母細(xì)胞中鎘的積累。
[0039]本發(fā)明還描述了將OsPIPl ;1基因用于水稻的低鎘轉(zhuǎn)基因育種。水稻是一種淹水地 栽培的農(nóng)作物,對水分的需求極其旺盛,而水通道蛋白主要負(fù)責(zé)對水的吸收和轉(zhuǎn)運,因此水 稻體內(nèi)的水通道基因?qū)λ镜恼IL及其重要。在本發(fā)明中,我們首次將水稻的水通道 蛋白基因和水稻對重金屬鎘的積累聯(lián)系起來,通過RNAi技術(shù)下調(diào)OsPIPl;l基因在水稻中的 表達(dá),可以獲得稻米中低富集鎘的水稻轉(zhuǎn)基因品系。
[0040]本發(fā)明中,用于構(gòu)建水稻轉(zhuǎn)基因RNA干涉載體為pTCK303,該載體來源于 PCAMBIA1301。以重組質(zhì)粒OsPIPl; 1-pGEM T為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計引物為OsPIPl; 1RIF: S'-GGGGTACCACT
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