抗癌萃取物及化合物的制作方法
【專利說明】
[00011 本申請是申請?zhí)枮?01180047555.6，申請日為2011年9月30日，發(fā)明名稱為"抗癌 萃取物及化合物"的中國專利申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明為關(guān)于自植物中萃取的具有抗癌活性的新穎萃取物及新穎化合物。
【背景技術(shù)】
[0003] 石蓮(Graptopetalum paraguayense，GP)為一種中國傳統(tǒng)中草藥，且對于健康有 多種幫助。根據(jù)其古老的中國處方，GP被認為具有多種有益效用，如:緩和肝的病癥、降低血 壓、美白、緩解疼痛及感染、抑制發(fā)炎及改善腦部的功能。
[0004] 于研究中發(fā)現(xiàn)，GP的葉子萃取物可抑制酪胺酸酶及血管收縮素轉(zhuǎn)化酶的活性，以 及于體外試驗中可清除自由基（Chen，S-J等，石蓮（Graptopetalum paraguayense E.Walther)萃取物于血管收縮素轉(zhuǎn)化酶的抑制效果的研究<^〇〇(1〇161^8杜7 100:1032-1036，2007;Chung，Y_C等，石蓮（Graptopetalum paraguayense E .Walther)的抗氧化活性 的研究。Food Chemistry 91:419-424,2005;及 Huang，K_F等，石蓮（Graptopetalum paraguayense E.Walther)萃取物于燕類酪胺酸酶的抑制效果的研究Food Chemistry 89: 583-587，2005)。另外，發(fā)現(xiàn)GP的水、及50 %乙醇的、及95 %乙醇的莖部萃取物具有抗氧化活 性，該等萃取物亦以人類HCC細胞株(HepG2)的增生作用，進行抑制效果的分析(Chen，S J等， 石蓮的莖部萃取物于體外試驗的抗氧化活性及抗增生活性Am J Chin Med36 :369-383， 2008)。體內(nèi)試驗研究證明GP的葉子萃取物可抑制小神經(jīng)膠質(zhì)細胞活化、氧化壓力及iNOS表 現(xiàn)，以降低缺血性腦損傷(Kao，TK等，石蓮(Graptopetalum paraguayense E· Walther)的葉 子萃取物于缺血性老鼠中可保護、抵抗腦損傷Am J Chin Med 38:495-516,2010)。
[0005] 由Hsu等人于2004年申請的美國專利（專利號：7,364,758)，其的體內(nèi)及體外試驗 中石蓮乙醇萃取物具有抗肝纖維化及抗發(fā)炎功效于2008年被授予專利。接著，其的部分連 續(xù)申請案(美國專利號7，588，776)于2008年提出申請，并于2009年授予專利，其發(fā)現(xiàn)石蓮水 溶性分液對于肝病或肝狀況，如發(fā)炎、脂肪變性、及纖維化，具有治療效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明關(guān)于從植物中所分離的一種新穎萃取物及其分液及新穎化合物;該植物尤 其是指縞瓣屬(Graptopetalum sp)的植物。本發(fā)明亦提供一種使用該新穎萃取物或新穎化 合物以治療癌癥的新穎方法，該癌癥尤其是指肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma， HCC) 〇
[0007] 在一方面，本發(fā)明提供一種具有抗癌活性的萃取物，該萃取物是以二甲基亞砜 (Dimethyl sulfoxide，DMS0)從植物中萃取，該植物是選自由縞瓣屬（Graptopetalum sp.)、紅景天屬(Rhodiola sp.)及石蓮花屬(Echeveria sp.)所組成的群組。在本發(fā)明中不 可預期地發(fā)現(xiàn)了該DMS0萃取物具有抗癌活性。
[0008] 于本發(fā)明的一具體實施例中，該植物為石蓮(Graptopetalum paraguayense)或紅 景天(Rhodiola rosea)。于本發(fā)明的一實例中，藉由30%DMS0萃取該植物以取得該萃取物。
[0009] 另一方面，本發(fā)明提供來自植物的含有豐富抗癌成分的分液，該植物為選自由縞 瓣屬(Graptopetalum sp·)、紅景天屬(Rhodiola sp.)及石蓮花屬（Echeveria sp.)所組成 的群組；尤其為石蓮(Graptopetalum paraguayense)或紅景天(Rhodiola rosea);該分液 是藉由二甲基亞砜(DMS0)萃取該植物，并藉由色層分析分離而制備得的分液，稱為HH-F3， 該分液具有細胞毒殺作用，及于癌細胞中向下調(diào)控AURKA、AURKB、及FLJ10540的表現(xiàn)的效 果。
[0010] 本發(fā)明的一具體實施例中，使用Sephadex LH-20管柱作為層析管柱。根據(jù)本發(fā)明， 該分液具有高度的細胞毒殺效果，以及于Huh7及HepG2細胞中，具有向下調(diào)控AURKA、AURKB、 及FLJ10540的表現(xiàn)的效果。
[0011]于分液HH-F3的機轉(zhuǎn)研究方面，發(fā)現(xiàn)分液HH-F3可誘發(fā)HCC進行細胞凋亡。換句話 說，分液HH-F3對于癌細胞，尤其是HCC，具有療效。
[0012] 又一方面，本發(fā)明提供一化合物，該化合物具有下式I的結(jié)構(gòu)式，
[0013]
[0016]
OH
[0017] 以及該原飛燕草素(PD)單元的結(jié)構(gòu)為
[0018]
[0019] 根據(jù)本發(fā)明，具有式I結(jié)構(gòu)式的化合物可分離自植物，該植物是選自由縞瓣屬 (Graptopetalum sp·)、紅景天屬（Rhodiola sp.)或石蓮花屬(Echeveria sp.)所組成的群 組。本發(fā)明的一具體實施例中，該化合物是從石蓮(Graptopetalum Paraguayense)或紅景 天(Rhodiola rosea)的分液中純化而得。具有式I結(jié)構(gòu)式的化合物被發(fā)現(xiàn)富含3，4,5-三輕 基苯甲基部份(moieties)且具抗癌活性。
[0020] 又另一方面，本發(fā)明提供一組合物或一醫(yī)藥組合物，其包含本發(fā)明的萃取物、分液 或化合物，及醫(yī)藥上可接受的載劑。再者，該醫(yī)藥組合物具有抗癌活性，其可用以有效預防 或治療癌癥，如:肝癌，尤其是HCC。
[0021] 再一方面，本發(fā)明提供該萃取物、該分液或具有式I結(jié)構(gòu)式的化合物于制備用以治 療癌癥(尤其是HCC)的醫(yī)藥的用途。
[0022] 又一方面，本發(fā)明提供一種預防或治療癌癥的方法，其包含投與治療有效量的本 發(fā)明的萃取物、分液或化合物至有需求的對象。在本發(fā)明一實例中，該癌癥為HCC。
【附圖說明】
[0023]本發(fā)明前述的
【發(fā)明內(nèi)容】
，以及的后的詳細說明，于閱讀時可配合圖示以更加了解。 為了闡述本發(fā)明，所呈現(xiàn)的圖示為具體實施例中較佳的呈現(xiàn)方式。需明了的是，本發(fā)明并不 受限于該等具體實施例，或其呈現(xiàn)的圖示。
[0024] 于圖示中：
[0025] 圖1提供本發(fā)明的分液HH-F3的HPLC圖譜，其中該層析圖譜及該梯度沖提曲線分別 以X線及Y線表示。
[0026]圖2中顯示本發(fā)明的分液HH-F3于增加細胞毒殺作用的功效;其中圖2(A)圖顯示于 Huh7細胞的效果，及圖2(B)圖顯示于Mahlavu細胞的效果;將自不同溶劑所制得的萃取物進 行比較;其中Huh7(A)及Mahlavu(B)細胞為以自水、丙酮、甲醇、100%乙醇、70%乙醇、50% 乙醇、100%DMS0、及 30%DMS0 制備的 GP 萃取物，以 100、150、250、500、750、1000、&1500yg/ ml的濃度處理72小時，接著將該等細胞進行MTT分析。于該等萃取制備物中，該30%DMS0的 GP萃取物，于72小時時，具有明顯抑制Huh7及Mahlavu細胞存活性的功效。
[0027]圖3中顯示本發(fā)明的分液HH-F3，于HSC-T6 (A)、及HepG2及Huh7細胞（（B)及（C))的 間期（interphase)及Μ期中，可降低許多有絲分裂調(diào)控子的降解;其中（A)HSC-T6細胞是以 30%DMS0 GP萃取物處理。將細胞溶解物以抗Fljl0540及抗Aurkb抗體進行免疫墨點法分 析；（B)HepG2及Huh7細胞是以不同濃度的30%DMS0 GP萃取物處理，及將細胞溶解物以抗 FLJ10540、抗AURKA、及抗AURKB抗體，進行免疫墨點法分析。（C)HepG2及Huh7細胞是以75ng/ ml諾可達唑(nocodazole，N0C)處理16~18小時。經(jīng)過同步劑（synchronizing agent)前處 理后，該等細胞遂以750μg/ml 30%DMS0 GP萃取物或空白對照組（30%DMS0)再處理3小時； 再以抗FLJ10540、抗AURKA、及抗AURKB抗體進行西方墨漬法;下列數(shù)點需特別注意：（1)相較 于位于間期的細胞，AURKA、AURKB、及FLJ10540可于有絲分裂的細胞中高度表現(xiàn);及(2)經(jīng)過 30%DMS0 GP萃取物處理后，可抑制于間期及中期(metaphase)的AURKA、AURKB、及FLJ10540 的蛋白表現(xiàn)程度。
[0028] 圖4中顯示本發(fā)明的分液HH-F3于HCC細胞株：Huh7細胞（A)、及HepG2及Huh7細胞 ⑶，的抑制AURKA蛋白表現(xiàn)的效果;其中(A)Huh7細胞是以500μg/ml濃度的GP萃取物處理48 小時；該等GP萃取物是從水、丙酮、甲醇、100%乙醇、70%乙醇、50 %乙醇、100% DMS0、及 30%DMS0所制得;顯示以30%DMSO GP萃取物處理后，可抑制AURKA的表現(xiàn)程度；（B)于HepG2 及Huh7細胞中，AURKA、AURKB、及FLJ10540的表現(xiàn)程度無法被水及BuOH分液所抑制。
[0029] 圖5中顯示本發(fā)明的分液HH-F3于兩個HCC細胞株:Huh7細胞(A)及Mahlavu細胞(B) 中所造成的細胞毒殺的時間及劑量相關(guān)性的反應；其中Huh7(A)及Mahlavu(B)細胞是以 30 %DMS0 GP萃取物，于0、250、500、750、及1000μg/ml的濃度處理24、48及72小時，接著進行 MTT分析。由30%DMS0 GP萃取物于Huh7及Mahlavu細胞所造成的生長抑制的IC50值，于48 小時，分別約為500及250μg/ml。
[0030] 圖6中顯示不同的GP純化分液于HCC細胞株中的AURKA蛋白表現(xiàn)的效果；包含圖6 (A)圖闡述本發(fā)明的GP萃取物及分液HH-F3的純化方式；圖6(B)圖顯示HepG2細胞是以30% DMS0 GP萃取物，HH-F1、HH-F2、HH-F3、及HH-F4，處理3小時。結(jié)果顯示，于Η印G2細胞處理HH-Fl、HH-F2、及HH-F4分液，無法抑制AURKA及AURKB表現(xiàn)程度；圖6 (C)圖顯示經(jīng)過30 %DMS0 GP 萃取物及HH-F3分液的處理后，可抑制AURKA的表現(xiàn)；以及圖6(D)圖顯示經(jīng)過HH-F3a分液的 處理后，可抑制AURKA的表現(xiàn)。
[0031] 圖7中顯示本發(fā)明的分液HH-F3于抑制Huh7細胞(A、E)、Mahlavu細胞(B、F)、PLC5細 胞(C、G)、及 HSC-T6 細胞(D)的細胞存活性的效果；其中 Huh7(A、E)、Mahlavu(B、F)、PLC5(C、 6)、及批(^6(0)細胞是以冊43分液，于5、25、50、及75以8/1111的濃度，處理24、48、及72小時， 之后接著進行MTT分析(A至D)及臺酸藍（trypan blue)分析(E至F)。于Huh7、Mahlavu、PLC5、 及HSC-T6細胞中，經(jīng)由HH-F3分液處理，所造成的細胞存活性抑制效果的IC50值，經(jīng)過處理 72小時后，分別約為50、37 · 5、75、及20μg/ml。
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