一種用于防治煙蚜的擬青霉屬菌株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于防治煙蚜的擬青霉屬菌株。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人們對(duì)自身健康和生存環(huán)境關(guān)注程度的日益增強(qiáng)，傳統(tǒng)的害蟲(chóng)化學(xué)防治措施所帶來(lái)的弊端，已經(jīng)引起人們的極大重視?；瘜W(xué)農(nóng)藥泛濫使用導(dǎo)致環(huán)境中農(nóng)藥殘留的增加，病蟲(chóng)抗藥性的增強(qiáng)和病蟲(chóng)的再度猖獗等問(wèn)題最為突出。隨著世界各國(guó)對(duì)化學(xué)農(nóng)藥所帶來(lái)的種種社會(huì)問(wèn)題、環(huán)境問(wèn)題、以及人類(lèi)健康問(wèn)題的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，越來(lái)越多的化學(xué)農(nóng)藥被限制使用或禁止使用。生物農(nóng)藥作為一種低毒、低殘留，并且病蟲(chóng)害不易產(chǎn)生抗藥性的新型農(nóng)藥，自然就成為現(xiàn)代農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)關(guān)注并試圖開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)，其研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化也成為國(guó)家的戰(zhàn)略需求。
[0003]微生物農(nóng)藥是生物農(nóng)藥的重要一類(lèi)，包括農(nóng)用抗生素和活體微生物農(nóng)藥。微生物農(nóng)藥是從天然產(chǎn)物中分離純化出來(lái)的，可以直接作用于病蟲(chóng)害防治，也可以作為先導(dǎo)化合物合成新的農(nóng)藥。這些農(nóng)藥既可以保留原有生物活性物質(zhì)的低毒、低殘留等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了某些天然產(chǎn)物的穩(wěn)定性差、活性不高等不足，使得生物活性物質(zhì)的潛力得到充分挖掘。
[0004]真菌是開(kāi)發(fā)微生物農(nóng)藥的重要資源，世界各國(guó)投入了大量的科研力量予以研究。目前已經(jīng)注冊(cè)的以陸生真菌或其代謝產(chǎn)物為有效成分的生物農(nóng)藥達(dá)70余種，這些微生物農(nóng)藥被廣泛應(yīng)用于防治植物病害、蟲(chóng)害和田間雜草。我國(guó)在應(yīng)用和基礎(chǔ)研究方面也取得了十分突出的成績(jī)。盡管我國(guó)當(dāng)前生物農(nóng)藥的產(chǎn)量?jī)H占農(nóng)藥總產(chǎn)量的9%，但從人類(lèi)長(zhǎng)遠(yuǎn)利益角度考慮和農(nóng)藥發(fā)展趨勢(shì)來(lái)看，生物農(nóng)藥的發(fā)展?jié)摿κ志薮?。海洋真菌?lái)源于海洋環(huán)境，并不是陸地生物的寄生菌，在直接以微生物活體作為有效殺蟲(chóng)劑或殺菌成分的生物農(nóng)藥開(kāi)發(fā)模式面前，海洋真菌于陸地真菌相比，沒(méi)有優(yōu)勢(shì)可言，但在以微生物代謝為有效成分的農(nóng)藥開(kāi)發(fā)模式下，海洋真菌卻具有很大優(yōu)勢(shì)。
[0005]海洋真菌的生存環(huán)境比較苛刻(高鹽、高壓、缺氧、低營(yíng)養(yǎng)、無(wú)光照等)，為求得生存空間，它們?cè)陂L(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生了一些結(jié)構(gòu)獨(dú)特的次生代謝物質(zhì)，特別是海洋動(dòng)植物共附生真菌，為爭(zhēng)取自身的最大生存，通過(guò)分泌具有各種生物活性的代謝物來(lái)積極地參與動(dòng)植物的代謝活動(dòng)，在動(dòng)植物的抗感染、抗吞噬的生態(tài)防衛(wèi)中發(fā)揮了重要的作用，被認(rèn)為是篩選抗生素的最佳對(duì)象。從海洋真菌中分離得到的新化合物70%_80%具有各種各樣的生物活性，也已引起化學(xué)家和生物學(xué)家的極大關(guān)注，種類(lèi)包括萜類(lèi)、肽類(lèi)、生物堿、酮類(lèi)以及酯類(lèi)化合物，其中有很多是某些殺蟲(chóng)劑、殺菌劑的有效成分或前體物質(zhì)。關(guān)于海洋真菌次生代謝物的功能與用途，研究者較多的關(guān)注于治療人類(lèi)疾病的醫(yī)用藥物的開(kāi)發(fā)，海洋真菌代謝物農(nóng)用殺蟲(chóng)、殺菌功能的研究較少。
[0006]煙蚊Myzus persicae(Sulzer)屬同翅目蚊科，是重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)之一，可為害煙草、十字花科蔬菜、桃樹(shù)等多種植物，同時(shí)也是黃瓜花葉病毒(CMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)等多種植物病毒的傳播媒介。目前，煙蚜的防治最有效的方法仍是化學(xué)防治，同時(shí)也有諸多有關(guān)生物防治方法的成功應(yīng)用(例如天敵煙蚜繭蜂的繁殖和釋放等)，但對(duì)于利用海洋微生物次生代謝物來(lái)探索開(kāi)發(fā)煙蚜生物制劑還未見(jiàn)報(bào)道。因此本試驗(yàn)將從生物防治方面進(jìn)行探索，篩選對(duì)煙蚜有毒殺活性的海洋真菌菌株，為將來(lái)利用這些菌株及其次生代謝產(chǎn)物開(kāi)發(fā)生物制劑防治煙蚜提供研究基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一株用于防治煙蚜的菌株，即一株來(lái)自海洋底泥的擬青霉屬(Paecl1myces.sp)菌種及其在煙蚜生物防治中的應(yīng)用，同時(shí)將篩選的可產(chǎn)生對(duì)煙蚜有生物活性次生代謝物的菌株應(yīng)用到煙蚜的生物防治中，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0008]本發(fā)明的擬青霉(Paecl1myces.sp)mfn21菌株，已于2015年11月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為:CGMCC N0.11659。
[0009]本發(fā)明篩選的mfn21菌株的生長(zhǎng)溫度范圍為25?30°C，最佳生長(zhǎng)溫度為28°C;最適pH值為10.0;使用的培養(yǎng)基為PDA海水培養(yǎng)基。
[0010]本發(fā)明篩選的mfn21菌株用于防治煙蚜，也可用來(lái)制備具有防治煙蚜功能的制品。
[0011]本發(fā)明的mfn21菌株的代謝產(chǎn)物，其制備方法如下:
[0012]1)首先將mfn21菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)液中培養(yǎng)基去掉，獲得的菌體中加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取;將萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后制成浸膏；
[0013]2)取D101大孔吸附樹(shù)脂，先用去離子水洗凈，再用無(wú)水乙醇洗至液體不渾濁;將處理后的D101大孔吸附樹(shù)脂上柱后，用氫氧化鈉洗至中性，再用鹽酸洗至流出液呈酸性，去離子水洗至中性后，將步驟1)制備的浸膏用甲醇溶解后，再用等量去離子水混合，用大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附24h，然后用無(wú)水乙醇梯度洗脫，洗脫液減壓濃縮獲得mfn21菌株的代謝產(chǎn)物。
[0014]上述的代謝產(chǎn)物用于防治煙蚜。
[0015]本發(fā)明獲得的對(duì)煙蚜有生物活性的mfn21菌株，可應(yīng)用于煙草上煙蚜的防治，采用微量點(diǎn)滴法對(duì)煙蚜的生物測(cè)定表明，其發(fā)酵液中次生代謝物對(duì)煙蚜的致死率最高可達(dá)97.78%。采用GC/MS進(jìn)行化學(xué)分析和結(jié)構(gòu)鑒定后，次生代謝物包括有7種主要化合物，其中生物堿類(lèi)化合物2種，酯類(lèi)化合物2種、糖苷類(lèi)化合物，肽類(lèi)化合物、醇類(lèi)化合物各1種。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的菌株進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0017]一、擬青霉屬Paecl1myces.sp mfn21 菌株的篩選
[0018]無(wú)菌條件下，用已酒精滅菌的注射頭將底泥樣品10g從采樣玻璃管中取出，加入盛有100mL滅菌海水的三角瓶中，置恒溫振蕩器上，150rpm振蕩20min，使沉積物顆粒均勻分散。將制備好的沉積物懸液靜置5min，吸取200yL上清液涂布平板，放置在常溫條件下培養(yǎng)，從形成的菌落的邊緣挑取菌絲體移植到PDA平板上，純化后獲得該菌株。經(jīng)18s rDNA ITS基因序列分析鑒定為枝頂孢屬(Acremonium sp.)。經(jīng)18s rDNA ITS基因序列分析鑒定為擬青霉屬屬(Paecl1myces.sp)。
[0019]二、mfn21菌株的形態(tài)、理化參數(shù)
[0020]l、mfn21菌株的形態(tài)特征
[0021]顯微鏡下觀察，mfn21菌絲透明，分隔，表面光滑。分生孢子梗散生或聚集成簇，多由輪狀或不規(guī)則的瓶梗狀分枝組成，其頂部著生產(chǎn)孢瓶體，產(chǎn)孢瓶梗也可單生于營(yíng)養(yǎng)菌絲上。瓶梗由柱狀或膨大的基部和變細(xì)的頸部組成;分生孢子常形成鏈或單生，無(wú)隔膜，壁光滑，透明，橢球形至球形，直徑3.4-4.6μηι。無(wú)厚垣孢子。
[0022]2、培養(yǎng)條件
[0023]mfn21菌株在TOA平板上培養(yǎng)后，菌落稍突起，紫色至淡褐色。25°C