;經(jīng)pH6.0-10.0的緩沖液處理lh，該酶剩余酶活約55%以 上（圖4)。
[0060] 3、純化的重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag的熱活性及熱穩(wěn)定性測(cè)定：
[00611酶的最適溫度測(cè)定:在pH6的緩沖液中，于0-60°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶的熱穩(wěn)定性 測(cè)定:將同樣酶量的酶液置于30°C、37°C、45°C和50°C中，處理0_60min后，在pH6及45°C下進(jìn) 行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對(duì)照。以pNP-GlcNAc為底物，反應(yīng)lOmin，測(cè)定HJ5nag的酶 學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：HJ5nag的最適溫度為45°C(圖5);該酶在30°C下處理lh，酶保持穩(wěn)定（圖 6)0
[0062] 4、不同金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)純化的重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag活力的影響：
[0063] 在酶促反應(yīng)體系中加入ImM和1 OmM或0.5 % (v/v)和1 % (v/v)的金屬離子及化學(xué)試 劑，研究其對(duì)酶活性的影響。在45°C及pH6條件下，以pNP-GlcNAc為底物測(cè)定酶活性。結(jié)果 (表 1)表明，ImM和 10mM的SDS、AgN03和HgCl2可完全抑制HJ5nag; 10mM的FeS〇4對(duì)HJ5nag的抑 制較強(qiáng)，10mM的ZnS〇4對(duì)HJ5nag的抑制較弱；而0 · 5% (v/v)的Tween-80可激活HJ5nag;其余 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)HJ5nag基本無(wú)影響。
[0064] 表1.金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag活力的影響
[0065]
[0067] 5、純化的重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag對(duì)底物的降解：
[0068] 在 pH6 及 45°C 下，重組β-Ν_乙酰葡糖胺酶 HJ5nag對(duì)pNP_GlcNAc、pNP_GalNAc、二乙 酰殼二糖及四乙酰殼四糖的酶活分別為1773.1U mg-\146.0U mg-\481.4U mg-\445.0U mg 1 ^ AT M NP-nitrophenyl-a-D-galactopyranoside^.p-nitrophenylP-D- glucopyranoside 均無(wú)酉每活。
[0069] 6、純化的重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag水解幾丁寡糖的產(chǎn)物分析：
[0070] 產(chǎn)物分析反應(yīng)體系含80yL0.5%(w/v)的幾丁寡糖和80yL純酶液，在pH6及37°C下， 反應(yīng)6h。采用薄層層析法進(jìn)行產(chǎn)物分析，薄層層析法步驟如下：
[0071] (1)配制展開(kāi)劑(冰醋酸、雙蒸水、正丁醇體積比為1:1:2,配制適量)倒入展開(kāi)槽， 靜置約30min;
[0072] (2)將硅膠板放于110°C烘箱活化30min，冷卻后劃線，點(diǎn)樣(每次0.5yL，吹干，共點(diǎn) 3次)；
[0073] (3)將點(diǎn)樣的一端硅膠板朝下放入展開(kāi)槽，點(diǎn)樣點(diǎn)不可沒(méi)入展開(kāi)劑；
[0074] (4)待展開(kāi)劑到硅膠板上沿1.5cm時(shí)，取出硅膠板，吹干，再展一次；
[0075] (5)第二次展開(kāi)結(jié)束后，硅膠板直接浸入適量顯色劑（lg二苯胺溶入50ml丙酮，溶 解后加 lml苯胺及5ml85%的磷酸，混勾，現(xiàn)用現(xiàn)配）；
[0076] (6)幾秒后，立即取出硅膠板并放入90°C烘箱10_15min，使斑點(diǎn)顯色
[0077] 結(jié)果表明，HJ5nag可將二乙酰殼二糖及四乙酰殼四糖水解為N-乙酰-D-胺基葡萄 糖單糖(圖7)。
[0078] 7、N_乙酰-D-胺基葡萄糖對(duì)重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag活性的影響
[0079] 在酶促反應(yīng)體系中加入終濃度為0-20mM N-乙酰-D-胺基葡萄糖，于pH6.0及45°C 下進(jìn)行酶促反應(yīng)。以pNP-GlcNAc為底物，反應(yīng)lOmin，測(cè)定純化的HJ5nag的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表 明：當(dāng)反應(yīng)體系加入終濃度20mM N-乙酰-D-胺基葡萄糖時(shí)，該酶仍保留約69.5%的活性，表 明N-乙酰-D-胺基葡萄糖對(duì)HJ5nag抑制作用較低（圖8)。
[0080] 8、β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag與幾丁質(zhì)酶協(xié)同作用水解幾丁質(zhì)
[0081]幾丁質(zhì)預(yù)處理:幾丁質(zhì)用85%磷酸溶解后，再用雙蒸水一直洗滌至pH呈中性，成為 膠體幾丁質(zhì)。在PH6.0及25°C條件下，采用DNS法，分別用海源葉生物科技有限公司的商業(yè)內(nèi) 切幾丁質(zhì)酶和HJ5nag水解膠體幾丁質(zhì)，反應(yīng)2h;同時(shí)添加內(nèi)切幾丁質(zhì)酶和HJ5nag水解膠體 幾丁質(zhì)；內(nèi)切幾丁質(zhì)酶和HJ5nag在不同時(shí)間條件下水解膠體幾丁質(zhì)。結(jié)果(表2)表明：β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag與商業(yè)內(nèi)切幾丁質(zhì)酶可協(xié)同降解膠體幾丁質(zhì)，同時(shí)添加內(nèi)切幾丁質(zhì)酶 和HJ5nag或添加內(nèi)切幾丁質(zhì)酶作用30min后加入HJ5nag再作用lh30min，還原糖生成量都可 提高大約1倍。
[0082]表2.β-Ν_乙酰葡糖胺酶HJ5nag與商業(yè)內(nèi)切幾丁質(zhì)酶協(xié)同降解幾丁質(zhì) [0083]
[0084]注:CK:內(nèi)切幾丁質(zhì)酶與底物作用2h;Sl:HJ5nag與底物作用2h;S2:內(nèi)切幾丁質(zhì)酶 與HJ5nag共同作用2h;S3:內(nèi)切幾丁質(zhì)酶作用30min后加入HJ5nag再作用lh30min;S4:內(nèi)切 幾丁質(zhì)酶作用lh后加入HJ5nag再作用lh; S5:內(nèi)切幾丁質(zhì)酶作用lh30min后加入HJ5nag再作 用30min。
[0085]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶，其特征在于，所述耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡 糖胺酶的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。2. 如權(quán)利要求1所述的耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶，其特征在于，所述耐產(chǎn)物抑制 的β-Ν-乙酰葡糖胺酶總共含535個(gè)氨基酸，理論分子量為55.89kDa，其中Ν端有25個(gè)氨基酸 為預(yù)測(cè)信號(hào)肽序列MNRRRGRAIAAATVLAASLAGCSPA，成熟的β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag含510個(gè) 氨基酸。3. -種編碼權(quán)利要求1所述的β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag的β-Ν-乙酰葡糖胺酶基因 hJ5nag，其特征在于其核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。4. 一種如權(quán)利要求1所述耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶的制備方法，其特征在于，所 述耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶的制備方法包括以下步驟： 首先用包含β-Ν-乙酰葡糖胺酶基因hJ5nag的重組載體，重組載體為pEasy-E2-hJ5nag， 將乙酰葡糖胺酶基因插入到表達(dá)載體中，使核苷酸序列與表達(dá)調(diào)控序列相連接，重組載體 轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株； 然后培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag表達(dá)； 最后回收所表達(dá)的β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag。5. 如權(quán)利要求4所述耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶的制備方法，其特征在于，所述宿 主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞，將重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞BL21(DE3)，得到重組 菌株BL21(DE3)/hJ5nag。6. -種包含權(quán)利要求1所述耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶的重組載體。7. 如權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體是將β-Ν-乙酰葡糖胺酶的 基因插入到表達(dá)載體中，使核苷酸序列與表達(dá)調(diào)控序列相連接。8. -種包含權(quán)利要求1所述耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶的重組菌株。9. 如權(quán)利要求8所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢 桿菌或乳酸桿菌。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種耐產(chǎn)物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶及其制備方法，所述β-N-乙酰葡糖胺酶的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示；所述方法包括：首先用包含β-N-乙酰葡糖胺酶基因hJ5nag的重組載體，重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；然后培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組β-N-乙酰葡糖胺酶HJ5nag表達(dá)；最后回收所表達(dá)的β-N-乙酰葡糖胺酶HJ5nag。本發(fā)明的β-N-乙酰葡糖胺酶，最適pH6；最適溫度為45℃；可催化水解幾丁寡糖；在反應(yīng)體系加入終濃度20mM？N-乙酰-D-胺基葡萄糖時(shí)，該酶仍保留約69.5％活性；可與內(nèi)切幾丁質(zhì)酶協(xié)同降解幾丁質(zhì)，可應(yīng)用于海產(chǎn)品加工、醫(yī)學(xué)、功能性食品等行業(yè)。
【IPC分類】C12R1/07, C12N1/19, C12N15/56, C12N15/63, C12N9/42, C12N1/21, C12R1/85, C12R1/19, C12R1/225
【公開(kāi)號(hào)】CN105483102
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610023932
【發(fā)明人】周峻沛, 張蕊, 黃遵錫, 宋志鳳, 唐湘華, 李俊俊, 吳倩
【申請(qǐng)人】云南師范大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年4月13日
【申請(qǐng)日】2016年1月14日