一種青霉素g?；竿蛔凅w的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種通過(guò)基因定點(diǎn)突變方法獲得的合 成性能提高的青霉素 G?；竿蛔凅w、及其在生產(chǎn)β_內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 青霉素 G?；?Penicillin G Acylase，E.C.3.5.1.11，簡(jiǎn)稱(chēng)PGA)是制備半合成 內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素中的重要用酶，該酶主要用于水解青霉素 G和頭孢菌素 G，生成相應(yīng)的化 合物母核比如6-氨基青霉燒酸(6_細(xì)：[110?611；[(3；[11;[11；[03(^(1，6-4?4)和7-氨基-3-去乙酰氧 基頭抱燒酉愛(ài)（7-Amin0-deacetoxy-cephalosporanic-acid，7-ADCA) (Abian et al., Biotechnol Prog，2003，19(6)，1639-42，2003);還可用于催化母核6-APA、7-ADCA或其他母 核與各種D-氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)生成新的半合成β-內(nèi)酰胺抗生素(半合成青霉素和頭孢霉素） (Bruggink et al.l998；Yang and Wei 2003；Youshko et al.2004；Gabor et al.2005)0
[0003] 酶法合成β-內(nèi)酰胺抗生素的研究開(kāi)始于上世紀(jì)60年代。相對(duì)于化學(xué)法(Wegman et al·，Advanced Synthesis&Catalysis, 343(6-7) ,559-576,2001)，由于其具有不使用有機(jī) 溶劑、反應(yīng)條件溫和、以及環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，酶法合成β-內(nèi)酰胺抗生素逐漸成為β-內(nèi)酰胺抗生素 工業(yè)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)（Giordano，Ribeiro，and Giordano，Bio techno logy Advances，24 (1)，27-41，2006)。理論上，β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的酶法合成可通過(guò)下述兩種途徑實(shí)現(xiàn) (Kasche.Enzyme and Microbial Technology,8(1)，4_16，1986)，即1)熱力學(xué)控制，即逆轉(zhuǎn) 水解反應(yīng);和2)動(dòng)力學(xué)控制，即?；D(zhuǎn)移。動(dòng)力學(xué)控制的催化機(jī)制涉及酶和?；w反應(yīng)， 形成?；钢虚g體，當(dāng)中間體遇到內(nèi)酰胺母核即可發(fā)生耦合，形成半合成內(nèi)酰胺抗生 素;而水作為競(jìng)爭(zhēng)性親核性試劑，引起反應(yīng)物和產(chǎn)物的水解，當(dāng)產(chǎn)物合成速率與產(chǎn)物水解速 率相當(dāng)時(shí)，該合成產(chǎn)物量達(dá)到最大值。
[0004]目前，通過(guò)動(dòng)力學(xué)控制途徑，利用青霉素?；复呋w?；D(zhuǎn)移到β-內(nèi)酰胺類(lèi) 抗生素母核來(lái)生產(chǎn)半合成β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的酶法工藝已日益成為化學(xué)合成法的有效替 代（Bruggink et al·1998;Wegman et al·2001)。
[0005] 與傳統(tǒng)的化學(xué)合成法相比，β-內(nèi)酰胺抗生素的酶法合成面臨的主要問(wèn)題是：在合 成抗生素的同時(shí)又發(fā)生兩個(gè)副反應(yīng)，即1)水解活化的酰基供體和2)水解生成的抗生素，從 而導(dǎo)致?；w和生成的抗生素的減少，進(jìn)而造成了母核轉(zhuǎn)化率偏低，即合成產(chǎn)物/水解產(chǎn) 物(S/Η)的比值偏低，而且酶自身的特性對(duì)S/Η值的影響依然是最重要的(Alkema et al.， Eur.J.BiOChem，270(18)，3675-83,2003)。利用蛋白質(zhì)工程來(lái)改善青霉素 G?；傅暮铣尚?能已有報(bào)道(Alkema et al,Protein Eng. ,13(12),857-63,2000)。在大腸桿菌來(lái)源的青霉 素 G酰化酶中，aR 145、aF146和即24這三種氨基酸位于?；概c青霉素 G結(jié)合的口袋位置， 對(duì)酶的合成性能具有關(guān)鍵的作用（Alkema et al.，Protein Engineering Design& Selection,17(5),473-480,2004)。
[0006] 利用有理設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化結(jié)合的方法，青霉素 G?；窹AS2把a(bǔ)R160、aF161和i3F24 這三個(gè)氨基酸篩選到在氨芐青霉素和頭孢氨芐合成時(shí)性能大大提高的工程菌中（Gabor， E.M.and D.B.Janssen，Protein Eng Des 361，2004，17(7)，571_9)，上述報(bào)道都提高了青 霉素 G酰化酶的合成性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了得到合成性能、尤其是S/Η值進(jìn)一步提高的青霉素 G?；福景l(fā)明利用基因 工程技術(shù)來(lái)對(duì)微生物來(lái)源的野生型青霉素 G?；高M(jìn)行改造，構(gòu)建高合成性能的青霉素 G酰 化酶突變體，從而進(jìn)行內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的工業(yè)化生產(chǎn)。
[0008] 為此，本發(fā)明通過(guò)定點(diǎn)突變的方法對(duì)野生型青霉素 G?；高M(jìn)行改造和篩選，獲得 了高合成性能的突變體。
[0009] 因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種青霉素 G?；?。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供編碼上述青霉素 G?；傅幕颉?br>[0011] 本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供包含上述基因的質(zhì)粒。
[0012] 本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供轉(zhuǎn)化了上述質(zhì)粒的微生物。
[0013] 本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供上述酶或微生物在生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素中的用 途。
[0014] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0015] -種青霉素 G?；福浒被嵝蛄袨椋?br>[0016] SEQ ID Ν0:3,其為SEQ ID NO: 1第44位的D替換為L(zhǎng)的突變體，其氨基酸序列為：
[0017] MKQQWLSAALLAASSCLPAMAAQPVAPAAGQTSEAVAARPQTALGKVTIRRDAYGMPHVYADTVYGIFYGYGYAVAQ DRLFQMEMARRSTQGRVAEVLGASMVGFDKSIRANFSPERIQRQLAALPAADRQVLDGYAAGMNAWLARVRAQPGQL MPKEFNDLGFAPADWTAYDVAMIFVGTMANRFSDANSEIDNLALLTALKDRHGAADAMRIFNQLRWLTDSRAPTTVP AEAGSYQPPVFQPDGADPLAYALPRYDGTPPMLERVVRDPATRGVVDGAPATLRAQLAAQYAQSGQPGIAGFPTTSN MWIVGRDHAKDARSILLNGPQFGffffNPAYTYGIGLHGAGFDVVGNTPFAYPSILFGHNAHVTWGSTAGFGDDVDIFA EKLDPADRTRYFHDGQWKTLEKRTDLILVKDAAPVTLDVYRSVHGLIVKFDDAQHVAYAKARAWEGYELQSLMAWTR KTQSANWEQWKAQAARHALTINWYYADDRGNIGYAHTGFYPRRRPGHDPRLPVPGTGEMDWLGLLPFSTNPQVYNPR QGFIANWNNQPMRGYPSTDLFAIVWGQADRYAEIETRLKAMTANGGKVSAQQMWDLIRTTSYADVNRRHFLPFLQRA VQGLPADDPRVRLVAGLAAWDGMMTSERQPGYFDNAGPAVMDAWLRAMLRRTLADEMPADFFKWYSATGYPTPQAPA TGSLNLTTGVKVLFNALAGPEAGVPQRYDFFNGARADDVILAALDDALAALRQAYGQDPAAWKIPAPPMVFAPKNFL GVPQADAKAVLCYRATQNRGTENNMTVFDGKSVRAVDVVAPGQSGFVAPDGTPSPHTRDQFDLYNTFGSKRVWFTAD EVRRNATSEETLRYPR；
[0018] SEQ ID N0:4,其為SEQ ID NO: 1第130位的R替換為Μ的突變體，其氨基酸序列為：
[0019] MKQQWLSAALLAASSCLPAMAAQPVAPAAGQTSEAVAARPQTADGKVTIRRDAYGMPHVYADTVYGIFYGYGYAVAQ DRLFQMEMARRSTQGRVAEVLGASMVGFDKSIRANFSPERIQRQLAALPAADMQVLDGYAAGMNAWLARVRAQPGQL MPKEFNDLGFAPADWTAYDVAMIFVGTMANRFSDANSEIDNLALLTALKDRHGAADAMRIFNQLRWLTDSRAPTTVP AEAGSYQPPVFQPDGADPLAYALPRYDGTPPMLERVVRDPATRGVVDGAPATLRAQLAAQYAQSGQPGIAGFPTTSN MWIVGRDHAKDARSILLNGPQFGffffNPAYTYGIGLHGAGFDVVGNTPFAYPSILFGHNAHVTWGSTAGFGDDVDIFA EKLDPADRTRYFHDGQWKTLEKRTDLILVKDAAPVTLDVYRSVHGLIVKFDDAQHVAYAKARAWEGYELQSLMAWTR KTQSANWEQWKAQAARHALTINWYYADDRGNIGYAHTGFYPRRRPGHDPRLPVPGTGEMDWLGLLPFSTNPQVYNPR QGFIANWNNQPMRGYPSTDLFAIVWGQADRYAEIETRLKAMTANGGKVSAQQMWDLIRTTSYADVNRRHFLPFLQRA VQGLPADDPRVRLVAGLAAWDGMMTSERQPGYFDNAGPAVMDAWLRAMLRRTLADEMPADFFKWYSATGYPTPQAPA TGSLNLTTGVKVLFNALAGPEAGVPQRYDFFNGARADDVILAALDDALAALRQAYGQDPAAWKIPAPPMVFAPKNFL GVPQADAKAVLCYRATQNRGTENNMTVFDGKSVRAVDVVAPGQSGFVAPDGTPSPHTRDQFDLYNTFGSKRVWFTAD EVRRNATSEETLRYPRMKQQWLSAALLAASSCLPAMAAQPVAPAAGQTSEAVAARPQTADGKVTIRRDAYGMPHVYA DTVYGIFYGYGYAVAQDRLFQMEMARRSTQGRVAEVLGASMVGFDKSIRANFSPERIQRQLAALPAADMQVLDGYAA GMNAWLARVRAQPGQLMPKEFNDLGFAPADWTAYDVAMIFVGTMANRFSDANSEIDNLALLTALKDRHGAADAMRIF NQLRWLTDSRAPTTVPAEAGSYQPPVFQPDGADPLAYALPRYDGTPPMLERVVRDPATRGVVDGAPATLRAQLAAQY AQSGQPGIAGFPTTSNMffIVGRDHAKDARSILLNGPQFGffffNPAYTYGIGLHGAGFDVVGNTPFAYPSILFGHNAHV TWGSTAGFGDDVDIFAEKLDPADRTRYFHDGQWKTLEKRTDLILVKDAAPVTLDVYRSVHGLIVKFDDAQHVAYAKA RAWEGYELQSLMAWTRKTQSANWEQffKAQAARHALTINWYYADDRGNIGYAHTGFYPRRRPGHDPRLPVPGTGEMDff LGLLPFSTNPQVYNPRQGFIANWNNQPMRGYPSTDLFAIVWGQADRYAEIETRLKAMTANGGKVSAQQMWDLIRTTS YADVNRRHFLPFLQRAVQGLPADDPRVRLVAGLAAWDGMMTSERQPGYFDNAGPAVMDAWLRAMLRRTLADEMPADF FKWYSATGYPTPQAPATGSLNLTTGVKVLFNALAGPEAGVPQRYDFFNGARADDVILAALDDALAALRQAYGQDPAA WKIPAPPMVFAPKNFLGVPQADAKAVLCYRATQNRGTENNMTVFDGKSVRAVDVVAPGQSGFVAPDGTPSPHTRDQF DLYNTFGSKRVWFTADEVRRNATSEETLRYPR；
[0020] SEQ ID NO:5,其為SEQ ID NO: 1第186位的F替換為A的突變體，其氨基酸序列為：
[0021] MKQQWLSAALLAASSCLPAMAAQPVAPAAGQTSEAVAARPQTADGKVTIRRDAYGMPHVYADTVYGIFYGYGYAVAQ DRLFQMEMARRSTQGRVAEVLGASMVGFDKSIRANFSPERIQRQL