親和丙型病毒性肝炎核心抗原的核酸適體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種親和丙型病毒性肝炎核心抗原的核酸適體及 其應(yīng)用，具體涉及一種親和丙型病毒性肝炎核心抗原的核酸適體及其在輔助鑒定丙肝患者 中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV)引起的一種傳染性疾病，可以通過血液 或血制品感染。目前全世界有近2億人感染HCV，我國約有4000萬至5000萬人感染HCV， 僅次于乙型肝炎攜帶者數(shù)量。由于丙肝是RNA病毒引起的，目前世界范圍內(nèi)尚未開發(fā)出有 效的HCV疫苗。丙肝只有早發(fā)現(xiàn)、早治療，才能減輕病毒對肝細(xì)胞的破壞。因此，探索、開發(fā) 新型的HCV早期檢測方法具有非常重要的意義。
[0003] 判斷是否感染丙肝的唯一辦法是做丙肝血清檢測。目前丙型病毒性肝炎的血清學(xué) 診斷方法包括檢測抗HCV抗體和HCV RNA?？笻CV抗體一般出現(xiàn)在感染HCV12周后，并且有 相當(dāng)一部分病人體內(nèi)無抗HCV抗體，不利于對HCV的早期診斷。HCV RNA多出現(xiàn)于病毒感染 1周后，但臨床檢測易出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果。因此這些診斷方法或多或少的存在窗口 期檢測效果不理想、檢測技術(shù)操作復(fù)雜、儀器昂貴、大批量篩查能力不足等局限性，離早期 診斷與臨床血液或血制品篩查的要求還有相當(dāng)差距。已知HCV基因組編碼約3100個氨基 酸殘基組成的多聚蛋白，該蛋白在機(jī)體與病毒蛋白酶作用下可分解為核心抗原（core)、E1 結(jié)構(gòu)蛋白、E2結(jié)構(gòu)蛋白及p7非結(jié)構(gòu)蛋白、NS2非結(jié)構(gòu)蛋白、NS3非結(jié)構(gòu)蛋白、NS4A非結(jié)構(gòu)蛋 白、NS4B非結(jié)構(gòu)蛋白、NS5A非結(jié)構(gòu)蛋白、NS5B非結(jié)構(gòu)蛋白。HCV core蛋白出現(xiàn)于HCV感染 1周后，可作為HCV早期診斷及臨床篩查指標(biāo)，有望實(shí)現(xiàn)窗口期檢測。
[0004] 在國際上美國0RTH0公司于2000年推出了第四代HCV-ELISA試劑盒就是基于 HCVcore蛋白的檢測。在國內(nèi)，2005年湖南康潤生物工程有限公司也生產(chǎn)了類似的檢測HCV 病毒試劑盒。盡管這些試劑盒能夠檢測HCV抗原，但是因?yàn)檫@些試劑盒均采用雙抗體夾心 酶聯(lián)法（ELISA)進(jìn)行檢測，所以需要進(jìn)行大量單克隆抗體的制備。然而單克隆抗體的制備 過程復(fù)雜，價格昂貴，保存條件苛刻。這使得檢測HCV病毒的成本較高，檢測靈敏度也受到 嚴(yán)重的影響。
[0005] 核酸適體（Aptamer,又稱適配體，適配子）是能高親和性、高特異性的結(jié)合某種生 物革El標(biāo)的單鏈寡核酸分子（ssDNA或ssRNA)。核酸適體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù) (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, SELEX)從人工合成的 DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠高度特異性結(jié)合靶標(biāo)分子的單鏈DNA/RNA。已報道核酸適 體的靶標(biāo)包括金屬離子、有機(jī)小分子、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞甚至組織等。核酸適體的分子識別 功能與抗體類似，具有與抗體分子相當(dāng)甚至更強(qiáng)的靶標(biāo)識別能力，但與抗體相比具有很多 優(yōu)良的特性，如分子量小、能批量生產(chǎn)、不易失活、無免疫原性、容易合成與標(biāo)記、快速的穿 透組織、良好的代謝動力學(xué)、不同批次之間產(chǎn)品不會存在差異和具有很好化學(xué)穩(wěn)定性，在生 物檢測、疾病診斷治療等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種親和丙型病毒性肝炎核心抗原的核酸適體及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供的核酸適體，具體是如下（a)或（b):
[0008] (a)序列表的序列2所示的單鏈DNA ;
[0009] (b)含有（a)所述核酸適體的單鏈DNA。
[0010] 所述（b)中的核酸適體具體可為序列表的序列1所示的單鏈DNA。
[0011] 所述核酸適體與丙型肝炎病毒核心抗原具有較好的親和能力。
[0012] 將所述核酸適體進(jìn)行修飾或改造，得到的所述核酸適體的衍生物也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
[0013] 所述核酸適體的衍生物可為如下任意一種：
[0014] a)將所述核酸適體刪除部分或增加部分互補(bǔ)的核苷酸，得到的與所述核酸適體具 有相同功能的核酸適體的衍生物。
[0015] b)將所述核酸適體進(jìn)行核苷酸取代或部分修飾，得到的與所述核酸適體具有相同 功能的核酸適體的衍生物。
[0016] c)將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適體具有 相同功能的核酸適體的衍生物。
[0017] d)將核酸適體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的 衍生物。
[0018] e)將所述核酸適體連接上熒光、放射性和治療性物質(zhì)后，得到的與所述核酸適體 具有相同功能的核酸適體的衍生物。
[0019] 固定有所述核酸適體的酶標(biāo)板（如96孔板）也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020] 可采用酶聯(lián)放大法檢測待測樣本中的丙型肝炎病毒核心抗原，從而實(shí)現(xiàn)臨床中丙 型肝炎病毒的檢測。
[0021] 所述核酸適體可用于制備檢測或輔助檢測丙型肝炎病毒核心抗原的試劑盒；所述 丙型肝炎病毒核心抗原的核苷酸序列具體如序列表的序列3所示。
[0022] 所述核酸適體還可用于制備鑒定或輔助鑒定丙肝患者的試劑盒。
[0023] 本發(fā)明還保護(hù)一種檢測或輔助檢測丙型肝炎病毒核心抗原的試劑盒。
[0024] 所述檢測或輔助檢測丙型肝炎病毒核心抗原的試劑盒，具體可包括所述核酸適 體；所述丙型肝炎病毒核心抗原的核苷酸序列具體如序列表的序列3所示。
[0025] 所述試劑盒還可包括包被有抗所述丙型肝炎病毒核心抗原的單克隆抗體的酶標(biāo) 板（如96孔板）。所述包被有抗所述丙型肝炎病毒核心抗原的單克隆抗體的酶標(biāo)板具體可 為湖南康潤制藥有限公司生產(chǎn)的具有肝炎病毒核心抗原單克隆抗體的96孔板。通過包被 有丙型肝炎病毒核心抗原單克隆抗體的酶標(biāo)板和核酸適體可以檢測待測樣本中的丙型肝 炎病毒核心抗原。使用所述試劑盒時，采用的待測樣本具體可為血清。
[0026] 本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定或輔助鑒定丙肝患者的試劑盒。
[0027] 所述鑒定或輔助鑒定丙肝患者的試劑盒，具體可包括所述核酸適體。
[0028] 所述試劑盒還可包括包被有抗所述丙型肝炎病毒核心抗原的單克隆抗體的酶標(biāo) 板（如96孔板）。所述包被有抗所述丙型肝炎病毒核心抗原的單克隆抗體的酶標(biāo)板具體可 為湖南康潤制藥有限公司生產(chǎn)的具有肝炎病毒核心抗原單克隆抗體的96孔板。使用所述 試劑盒時，采用的待測樣本具體可為血清。
[0029] 在鑒定或輔助鑒定丙肝患者的試劑盒中，還可含有記載有如下內(nèi)容的說明書：
[0030] (1)進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)組和對照組：
[0031] 實(shí)驗(yàn)組：將待測者的離體血清加入到所述固定有所述核酸適體的酶標(biāo)板中，37°C 孵育1-2小時，洗滌后加入HRP修飾的丙型肝炎病毒核心抗原單克隆抗體，37°C孵育0. 5-1 小時，洗滌后加入顯色液A+B,顯色10分鐘；顯色后檢測450nm下的光吸收值，記為0D450實(shí) 驗(yàn)組s
[0032] 對照組：以臨床確診未患丙肝的健康人的離體血清替代所述實(shí)驗(yàn)組中的所述待測 者的離體血清，其余與所述實(shí)驗(yàn)組相同，測得的450nm下的光吸收值，記為(?450對照組± 〇， 〇為對照組多組平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；定義〇D450l|S肖值=±3 〇。
[0033] (2)根據(jù)步驟（1)的測定結(jié)果，按照如下確定所述待測者是否為丙肝患者：若所述 0D450_|纟與00450^^^；的比值大于1,則所述待測者為丙肝患者或候選為丙肝患者；反之， 則所述待測者不為丙肝患者或候選不為丙肝患者。
[0034] 丙肝目前尚沒有疫苗預(yù)防，因此早期檢測就顯得相當(dāng)重要。發(fā)展在"窗口期"內(nèi)查 出丙型肝炎病毒是目前國際研究和臨床的熱點(diǎn)問題。利用本發(fā)明的核酸適體，可以在丙型 肝炎病毒感染1周后，通過檢測丙型肝炎病毒核心抗原而不是抗體實(shí)現(xiàn)對丙型肝炎病毒的 檢測。本發(fā)明的核酸適體將有利發(fā)展丙肝檢測的新方法。
[0035] 本發(fā)明還保護(hù)固定有所述核酸適體的酶標(biāo)板在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒 可以檢測或輔助檢測丙型肝炎病毒核心抗原和/或鑒定或輔助鑒定丙肝患者；所述丙型肝 炎病毒核心抗原的核苷酸序列具體如序列表的序列3所示。
[0036] 所述核酸適體與丙肝核心抗原具有較好的親和能力，可以通過固定有核酸適體的 96孔板，采用酶聯(lián)放大方法檢測溶液中的丙肝核心抗原，從而實(shí)現(xiàn)臨床中丙肝病毒的檢測。 所述核酸適體與丙肝核心抗原具有較好的親和能力，可以通過固定有單克隆