三角梅BgGA20-OX1基因片段及其干涉重組載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)，尤其涉及一種三角梅BgGA20-0Xl基因片段及其干涉重 組載體。
【背景技術(shù)】
[0002] 三角梅原產(chǎn)巴西，19世紀(jì)后期引入我國。經(jīng)過多年的栽培，如今已在我國南方溫暖 地區(qū)如廣東、云南、福建等省廣泛種植，成為當(dāng)?shù)丶矣鲬魰缘幕ɑ?，深圳、廈門、珠海、三亞、 北海等城市還將其選為市花。三角梅適應(yīng)性強(qiáng)，易栽培管理，病蟲害較少，因而被廣泛地應(yīng) 用于各類庭院與公園綠地等的景觀建設(shè)。
[0003] 三角梅主要存在枝條徒長的問題，人工修剪的造型常因生長過快，枝條伸出而破 壞，嚴(yán)重降低其觀賞價(jià)值。同時(shí)，頻繁修剪還會(huì)增加人工成本。
[0004] 赤霉素在植物生長周期中扮演重要的角色，枝條的伸長與赤霉素有著密切的相關(guān) 關(guān)系。GA20氧化酶是赤霉素生物合成過程的關(guān)鍵酶和限速酶，因此可以通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi) GA20-OX基因的表達(dá)量來達(dá)到控制赤霉素生物合成量的目的，進(jìn)而控制三角梅的枝條徒長。
[0005] 植物體內(nèi)存在著保持GA水平穩(wěn)定的機(jī)制，這種機(jī)制可以通過GA20-氧化酶基因的 負(fù)調(diào)節(jié)得以實(shí)現(xiàn)。GA20氧化酶基因的克隆，使得在分子水平上研究GA20氧化酶的反饋調(diào)節(jié) 成為可能。目前已在多種植物中分離鑒定出GA20氧化酶基因，隨著克隆及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不 斷發(fā)展，GA20氧化酶基因已被轉(zhuǎn)進(jìn)多種植物體內(nèi)，并對(duì)其生物功能及作用機(jī)制進(jìn)行了研究。 研究表明通過調(diào)控GA20氧化酶基因的表達(dá)，可以控制植物體內(nèi)GAs (赤霉素)含量，從而改變 植物生長狀況和形態(tài)，培育新的植物品種。
[0006] RNAKRNA干擾)指同一基因序列的RNA正義鏈和其反義鏈同時(shí)表達(dá)所形成的雙鏈 RNA可以降解內(nèi)源靶基因的mRNA，調(diào)節(jié)和關(guān)閉基因的表達(dá)，引起基因沉默的現(xiàn)象。RNAi自發(fā) 現(xiàn)以來一直是人們研究的熱點(diǎn)，利用RNAi技術(shù)可以特異性的抑制生物體中目標(biāo)基因的表 達(dá)，從而達(dá)到改變生物體性狀的目的。RNAi技術(shù)作為一種新的技術(shù)方法，在各個(gè)生物研究領(lǐng) 域內(nèi)廣泛應(yīng)用并取得了很多重要成果，因此RNAi為大規(guī)模高效而復(fù)雜的功能基因組學(xué)研究 提供了一個(gè)便捷的平臺(tái)，也是植物遺傳改良的有力工具

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種三角梅BgGA20-0Xl基因干涉重組載體。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種三角梅BgGA20-0Xl基因片段，其特征在于，所述 基因片段的部分序列如SEQ ID N0:8所示。
[0009] 所述三角梅BgGA20-0Xl基因干涉重組載體為將所述三角梅BgGA20-0Xl基因片段 的干涉序列先后正向和反向克隆入載體質(zhì)粒pYLRNAi.5所得;所述三角梅BgGA20-0Xl基因 片段的干涉序列為三角梅BgGA20-0Xl基因的一部分序列。
[0010] 所述三角梅BgGA20-0Xl基因片段的干涉序列如SEQ ID N0:9所示。
[0011] 進(jìn)一步，所述載體質(zhì)粒為pYLRNAi. 5質(zhì)粒。
[0012] 所述三角梅BgGA20-0Xl基因干涉重組載體用于控制植物體內(nèi)的GAs含量，從而改 變植物生長狀況和形態(tài)的用途。
[0013] 本發(fā)明的實(shí)施例的結(jié)果表明：相對(duì)于非轉(zhuǎn)基因組織，轉(zhuǎn)基因組織(含干涉載體未經(jīng) 過繼代的Π 組陽性材料和含干涉載體且經(jīng)過繼代的ΙΠ 組陽性材料）內(nèi)的GAs含量明顯降低， 下降幅度最高可達(dá)52.51%;在經(jīng)過繼代后的愈傷組織中，GAs的含量也明顯偏低，說明本發(fā) 明所述的三角梅BgGA20-0Xl基因干涉重組載體在植物組織體內(nèi)對(duì)GAs的合成起到了明顯的 抑制作用，進(jìn)而對(duì)其生長產(chǎn)生了顯著的影響。
[0014] 采用本發(fā)明的有益效果是：
[0015] l.本發(fā)明克隆得到的三角梅BgGA20-0XlcDNA序列（SEQIDN0:10)，可直接應(yīng)用于 遺傳信息的基因分析和特異性引物的設(shè)計(jì)，進(jìn)行遺傳品種改良的干涉載體構(gòu)建和基因轉(zhuǎn)化 等。
[0016] 2.根據(jù)NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心）已知GA20-0X同源基因保守序列設(shè)計(jì)特 異引物，借助pYLRNAi . 5載體可實(shí)現(xiàn)BgGA20-0Xl干涉片段的構(gòu)建。
[0017] 3.對(duì)改良三角梅的株型結(jié)構(gòu)，建立其分子育種平臺(tái)打下重要基礎(chǔ)，并可作為其它 作物株型遺傳改良的重要參考依據(jù)。
【附圖說明】
[0018] 圖1是三角梅總RNA電泳圖。
[0019]圖2三角梅BgGA20_0Xl基因片段擴(kuò)增電泳圖。
[0020] 圖3三角梅BgGA20-0Xl基因片段3' RACE序列擴(kuò)增電泳圖。
[0021 ] 圖4三角梅BgGA20-0Xl基因片段序列BLAST比對(duì)分析圖。
[0022]圖5三角梅BgGA20-0Xl基因片段氨基酸序列BLAST比對(duì)分析圖。
[0023]圖6是13個(gè)GA20-0X1所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹圖。
[0024]圖7是本發(fā)明應(yīng)用到的干涉載體pYLRNAi . 5的結(jié)構(gòu)圖。
[0025]圖8是PCR擴(kuò)增獲得干涉正向片段電泳圖。
[0026] 圖9是pYLRNAi . 5-DNCKX1第一輪重組子菌落PCR檢測圖。
[0027] 圖10是BgGA20-0Xl_RNAi載體第二輪重組子酶切檢測圖。
[0028] 圖11是體式鏡下觀察愈傷組織⑶S染色結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附 圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例 中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明 書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0030] 如無特別說明，均為常規(guī)方法K參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版），科學(xué)出版社， 2002，J.薩姆布魯克等著3
[0031 ] 實(shí)施例1:三角梅BgGA20-0Xl基因的克隆
[0032] 1.選擇光葉三角梅(B.glabra'Meriol Fitzpatrick'）幼嫩的莖尖或葉片為材料， 用Trizol法提取總RNA(試驗(yàn)結(jié)果見附圖1)從圖中可以看出，其具有980bp左右的條帶。 Trizol RNA提取試劑購自英韋創(chuàng)津公司。以下步驟所用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司。
[0033] 2.以三角梅總RNA為模板，采用01igo(dT)18為引物，通過PCR反應(yīng)獲得三角梅cDNA 第一鏈。
[0034] (1)利用總RNA為模板，采用01 igo (dT) 18為引物，于PCR管中配制反應(yīng)液：
[0035] 總 RNA 9.5yL
[0036] 01ig〇(dT)18(50ymol/L) lyL〇
[0037] (2)70°C 反應(yīng) lOmin，冰浴冷卻 2min。
[0038] (3)在冰中向上述管中再加入 5X First-Strand Buffer 4 μ L
[0039] dNTP Mixture (2. 5mmol/L each) 4U：L I?nase: Inhibitor (40U/ y L·)' D. S μ L AMV Reverse Transcriptase (201/μ L) 1 μ L
[0040] Total 2:0 μ U
[0041 ] (4)42°C反應(yīng)lh，75°C反應(yīng)15min，冰浴5min，得到三角梅cDNA第一鏈，-20°c貯存?zhèn)?用。
[0042] 3.根據(jù)NCBI中已登記的GA20-OX同源保守序列，設(shè)計(jì)簡并性引物GA20-OX F(5'_ GTYGTYAACCATGGDGTTGATGC-3'）艮P 為 SEQ ID N0:1 和GA20_ox R(5'_ TCATGTCAGCTCTGTAATGCT-3'）即為SEQ ID N0:2,以上述cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(試驗(yàn)結(jié)果 見附圖2)從圖中可以看出，擴(kuò)增得至Ij750bp左右的清晰條帶。引物合成由英濰捷基(廣州）貿(mào) 易有限公司完成。以下反應(yīng)體系成分購自TaKaRa公司。
[0043] 反應(yīng)體系如下： Template： 1 μ] WXEX Taq Buffer： 2μL dNTP: mix (2. 5 mmol/L) ： 1:.. 6 .ML
[0044] GA20-QX F (10 Wnol/L)： 0. 8 Hi, GA2Q-OX R (10 IJfflQl/L)； 0. 8 WL EX Taq 酶（2:00?,/μL): 0. 1 μL ddH20： up to 2_L。
[0045] 擴(kuò)增條件為：
[0046]
[0047] 取5uL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0048] 4.將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體(Takara公司）上，再利用藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑取 陽性轉(zhuǎn)化子，接種于含Amp(購自奇華盛生物公司）的LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，用菌液進(jìn)行 PCR鑒定，采用通用引物FP1:57 -GTAAAACGACGGCCAGT-3'(見SEQ ID N0:3)和RP1:57 -CAGGAAACAGCTATGAd (見SEQ ID N0:4)，電泳檢測到與RT-PCR大小接近的條帶。最后經(jīng)過 基因測序，得到一段731bp的三角梅BgGA20-0Xl基因同源片段序列（見SEQ ID N0:5)。序列 測定由北京六合華大基因科技有限公司完成。SEQ ID NO:5序列如下：
[0049] 5， GATGACTTCTTTGACCAACCCTTGGCTTTAAAGCAAATGGCTCAAAGGAAATTTGGTGAGCATTGTGGCTATGCTAG TAGCTTCACGGGTAGGTTCTCCTCCAAGCTTCCTTGGAAGGAAACTTTGTCTTTTGGCTACTCTCCTAATCACAAGA CCATTGTCCAAGACTACTTCCATAATAGCTTGGGTGACAACTTCGACCACTTGGGGAGGGTGTACCAAGCATATTGT GATGCAATGAGCAAGCTATCATTAGAAATCGCAGAGCTACTTGGGCTAAGCCTTGGTGTGAAGAAACATTATTTCCG AGAGTTCTTTCAAGGCCATGACTCGGTTATGCGGCTCAACTATTATCCACCATGTCAAAGGCCCGATCTTACTCTCG GAACAGGTCCTCAT