用于測試高藻水生物毒性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及環(huán)境水體的檢測方法，尤其是涉及一種用于測試高藻水生物毒性的方法，該方法運(yùn)用釀酒酵母進(jìn)行檢測，建立了準(zhǔn)確檢測高藻水水樣生物毒性的方法，本方法最終結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，是對現(xiàn)有方法的有效改進(jìn)。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，日趨嚴(yán)重的水體富營養(yǎng)化已成為全球性的環(huán)境問題之一。當(dāng)在夏、秋季，湖泊、水庫、池塘等有時(shí)因一些藍(lán)藻大量繁殖形成水華，給人類帶來很大危害。高藻水中主要含有藍(lán)綠藻，己知的藍(lán)綠藻中有40余種可產(chǎn)生毒素毒素，而同一藻株也可產(chǎn)生多種不同的毒素。此類毒素具有水溶性，長期攝入會對人體造成危害。我國目前常用的水處理工藝難以將其徹底去除，使人們的身體健康受到威脅。
[0003]目前采用藻類毒素的毒性檢測通常采用生物檢測法，如小鼠口服或注射來間接衡量毒性，毒性強(qiáng)弱用半致死劑量表示。此外還有用無脊椎動物如蝦、貝、水蚤及其卵進(jìn)行毒性評價(jià)的研究，以發(fā)光細(xì)菌進(jìn)行毒性試驗(yàn)也有報(bào)道。目前的方法可較粗略地判斷藻提取物是否有急性毒性，靈敏度較低，毒素消耗量大，需要大量的動物試驗(yàn)品，存在倫理問題，并且只能檢測總的毒性，不能檢測出細(xì)胞凋亡和壞死，對慢性毒性缺乏定量評價(jià)。。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是為了解決現(xiàn)有生物毒性檢測方法中存在結(jié)果粗略，靈敏度較低，毒素消耗量大，需要大量的動物試驗(yàn)品等問題，提供一種用于測試高藻水生物毒性的方法。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的實(shí)施方式提供了一種用于測試高藻水生物毒性的方法，該方法中，將釀酒酵母菌活細(xì)胞培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基，再挑單克隆接種于5%Yro液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期;分別加入磷酸緩沖液(PBS)為空白樣品A，加入高藻水樣為檢測樣品B，放置于混勻器上震蕩24小時(shí)，PBS洗滌細(xì)胞二次后分別配成濃度為IX 105-1X106cells/mL細(xì)胞懸液；加入5yg/mL Annexin V-FITC混勾后，再加入5yg/mL碘化丙啶(PI)混勻;室溫、避光、反應(yīng)5-15min;在1小時(shí)內(nèi)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測死細(xì)胞、活細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的比例，流式細(xì)胞術(shù)中激發(fā)波長Ex = 488nm;發(fā)射波長Em = 530nm;將樣品B的凋亡率和死亡率對照空白樣品A，即可判定水質(zhì)毒性。
[0006]進(jìn)一步，用于測試高藻水生物毒性的方法，包括如下步驟:
[0007]S1.含5 % YPD和1.5 %瓊脂固體培養(yǎng)基滅菌后加入釀酒酵母菌活細(xì)胞，YPD培養(yǎng)基與釀酒酵母菌菌種液體積比為1:150，待長出克隆后，再挑單克隆接種于5%Yro液體培養(yǎng)基中，置于恒溫氣浴培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，180-250rpm，25-28°c，振蕩培養(yǎng)過夜。取培養(yǎng)至對數(shù)期的菌種液待用，菌種液中0D值1.5-1.8;
[0008]S2.取0D值1.5-1.8菌種液，分別加入磷酸緩沖液(PBS)為空白樣品A，加入高藻水樣為檢測樣品B，放置于混勻器上震蕩24小時(shí)；
[0009]S3.將樣品A和B用PBS洗滌細(xì)胞二次，并分別配成濃度為1 X 105_1 X 106cellS/mL細(xì)胞懸液；
[0010]S4.A、B樣品均加入5yg/mL Annexin V-FITC混勻后，再加入5yg/mL碘化丙啶(PI)，混勻;室溫、避光、反應(yīng)5-15min;在1小時(shí)內(nèi)，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測；
[0011]S5.用流式細(xì)胞術(shù)(激發(fā)波長Ex = 488nm;發(fā)射波長Em = 530nm)檢測死細(xì)胞、活細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的比例；
[0012]S6.結(jié)果計(jì)算:將樣品B的凋亡率和死亡率對照空白樣品A，即可判定水質(zhì)毒性。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0014](1)釀酒酵母作為一種模式生物，它與一些復(fù)雜的生命形式具有很多相同的生命行為，特別在細(xì)胞循環(huán)控制、減數(shù)分裂和DNA修復(fù)方面與人類基因具有高度同源性，它具有易操作、增殖周期短、培養(yǎng)基簡單廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)，因此可用其細(xì)胞的凋亡率和死亡率簡便、可靠的判定水質(zhì)毒性。
[0015](2)能定量測定細(xì)胞凋亡率和壞死率，結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，能更細(xì)致的判斷高藻水生物毒性。
[0016]該方法運(yùn)用釀酒酵母針對藻類毒素進(jìn)行生物毒性檢測，最終結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，影響因素少，是對現(xiàn)有方法的有效改進(jìn)，具有較高的實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用潛力。
【附圖說明】
[0017]圖1為用于測試高藻水生物毒性的方法的毒性檢測結(jié)果示例圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的各實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)的闡述。然而，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，在本發(fā)明各實(shí)施方式中，為了使讀者更好地理解本申請而提出了許多技術(shù)細(xì)節(jié)。但是，即使沒有這些技術(shù)細(xì)節(jié)和基于以下各實(shí)施方式的種種變化和修改，也可以實(shí)現(xiàn)本申請各權(quán)利要求所要求保護(hù)的技術(shù)方案。
[0019]本發(fā)明中用于測試高藻水生物毒性的方法應(yīng)用于lOyg/mL藻毒素(MC-LR)生物毒性檢測:
[0020](1)將lml釀酒酵母菌菌種液加入5%YPD和1.5%瓊脂固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基中，其中接種假絲酵母菌菌種液濃度，以0D值計(jì)，在1.5以上為宜，置于恒溫氣浴培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出克隆后，再挑單克隆接種于5%Yro液體培養(yǎng)基中，150-200rpm，25-28°C，振蕩過夜培養(yǎng)至對數(shù)期(0D值在1.5-1.8左右)備用。
[0021 ] (2)配制lOyg/mL藻毒素(MC-LR)標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液模擬高藻水樣。取0D值1.5-1.8菌種液5mL，分別加入5mL磷酸緩沖液(PBS)為空白樣品A，加入5mL模擬高藻水樣為檢測樣品B，放置于混勻器上震蕩24小時(shí)。
[0022](3)將樣品A和B用PBS洗滌細(xì)胞二次，并分別配成濃度為1 X 105_1 X 106cellS/mL細(xì)胞懸液；
[0023](4)A、B樣品均加入5yg/mL Annexin V-FITC混勻后，再加入5yg/mL碘化丙啶(PI)，混勻;室溫、避光、反應(yīng)5-15min;在1小時(shí)內(nèi)，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。
[0024](5)用流式細(xì)胞術(shù)(激發(fā)波長Ex = 488nm;發(fā)射波長Em = 530nm)檢測死細(xì)胞、活細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的比例。
[0025]圖1是按上述方法檢測的結(jié)果示意圖。
[0026]將上述方法應(yīng)用于模擬高藻水的水質(zhì)生物毒性檢測，得出酵母細(xì)胞凋亡率為10.34%，壞死率為 67.41 %。
[0027]本發(fā)明將釀酒酵母細(xì)胞作為生物標(biāo)志物進(jìn)行高藻水的生物毒性評價(jià)，實(shí)現(xiàn)利用酵母細(xì)胞凋亡率和壞死率定量化檢測高藻水生物毒性，提高水質(zhì)生物毒性評價(jià)的靈敏性和準(zhǔn)確性，為高藻水體污染提供預(yù)警技術(shù)支持，保障供水水質(zhì)安全。
[0028]本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，上述各實(shí)施方式是實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體實(shí)施例，而在實(shí)際應(yīng)用中，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作各種改變，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.用于測試高藻水生物毒性的方法，其特征在于，該方法中，將釀酒酵母菌活細(xì)胞培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基，再挑單克隆接種于5 %Yro液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期;分別加入磷酸緩沖液為空白樣品A，加入高藻水樣為檢測樣品B，放置于混勻器上震蕩24小時(shí)，PBS洗滌細(xì)胞二次后分別配成濃度為1 X 105-1 X 106cells/mL細(xì)胞懸液;加入5yg/mL Annexin V-FITC混勻后，再加入5yg/mL碘化丙啶混勻；室溫、避光、反應(yīng)5_15min;在1小時(shí)內(nèi)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測死細(xì)胞、活細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的比例，流式細(xì)胞術(shù)中激發(fā)波長Ex = 488nm;發(fā)射波長Em =.530nm ；將樣品B的凋亡率和死亡率對照空白樣品A，即可判定水質(zhì)毒性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: S1.含5%YPD和1.5%瓊脂固體培養(yǎng)基滅菌后加入釀酒酵母菌活細(xì)胞，YPD培養(yǎng)基與釀酒酵母菌菌種液體積比為1:150，待長出克隆后，再挑單克隆接種于5%YPD液體培養(yǎng)基中，置于恒溫氣浴培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，180-250rpm，25-28°C，振蕩培養(yǎng)過夜，取培養(yǎng)至對數(shù)期的菌種液待用，菌種液中OD值1.5-1.8; S2.取OD值1.5-1.8菌種液，分別加入磷酸緩沖液為空白樣品A，加入高藻水樣為檢測樣品B，放置于混勻器上震蕩24小時(shí)； S3.將樣品A和B用PBS洗滌細(xì)胞二次，并分別配成濃度為1X 105-1 X 106cells/mL細(xì)胞懸液； S4.A、B樣品均加入5yg/mL Annexin V-FITC混勻后，再加入5yg/mL碘化丙啶(PI)，混勻;室溫、避光、反應(yīng)5-15min;在1小時(shí)內(nèi)，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測； S5.用流式細(xì)胞術(shù)檢測死細(xì)胞、活細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的比例，流式細(xì)胞術(shù)中激發(fā)波長Ex=.488nm ；發(fā)射波長 Em = 530nm ； S6.結(jié)果計(jì)算:將樣品B的凋亡率和死亡率對照空白樣品A，即可判定水質(zhì)毒性。
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于測試高藻水生物毒性的方法，其包括：釀酒酵母菌首先培養(yǎng)于含5％YPD和1.5％瓊脂固體培養(yǎng)基，待長出克隆后，再挑單克隆接種于5％YPD液體培養(yǎng)基中，180-250rpm，25-28℃，振蕩培養(yǎng)過夜；取OD值1.5-1.8菌種液，分別加入磷酸緩沖液為空白樣品A,加入高藻水樣為檢測樣品B，放置于混勻器上震蕩2小時(shí)；將樣品A和B用PBS洗滌細(xì)胞二次，并分別配成濃度為1×105-1×106cel？ls/mL細(xì)胞懸液；A、B樣品均加入5μg/mL？Annexin？V-FITC混勻后，再加入5μg/mL碘化丙啶，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5-15min；在1小時(shí)內(nèi)，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測；用流式細(xì)胞術(shù)檢測死細(xì)胞、活細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的比例；將樣品B的凋亡率和死亡率對照空白樣品A，即可判定水質(zhì)毒性。本發(fā)明為高藻水體污染提供預(yù)警技術(shù)支持，保障供水水質(zhì)安全。
【IPC分類】C12Q1/02, G01N33/18, C12R1/865
【公開號】CN105483202
【申請?zhí)枴緾N201610049076
【發(fā)明人】劉新續(xù)
【申請人】上海艾耐基新能源科技有限公司, 上海艾耐基環(huán)?？萍加邢薰?br>【公開日】2016年4月13日
【申請日】2016年1月25日