轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆bps-cv127-9的lamp檢測(cè)引物組、lamp檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【專利說明】轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127-9的LAMP檢測(cè)引物組、LAMP檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，屬于轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的檢測(cè)方法，具體的說是涉及轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127-9及其衍生物的LAMP檢測(cè)引物組、LAMP檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大豆是重要的油料作物，大豆產(chǎn)量位居世界上所有食用油料作物之首。大豆同時(shí)是一種優(yōu)質(zhì)高蛋白的植物資源，含有人體必需的8種氨基酸。大豆的原產(chǎn)地為中國(guó)，主產(chǎn)地主要有美國(guó)、巴西、阿根廷和中國(guó)。國(guó)產(chǎn)大豆不能滿足市場(chǎng)需求，進(jìn)口大豆的數(shù)量隨之增加。
[0003]BPS-CV127-9大豆是由巴斯夫植物科學(xué)公司研發(fā)，抗咪唑啉酮類農(nóng)業(yè)除草劑的大豆作物，含有耐除草劑擬南芥乙酰羥酸合成酶大亞基AHASL的基因csrl-2與其天然啟動(dòng)子。該抗除草劑的大豆能讓種植者在正常咪唑啉酮除草劑使用劑量下可以抑制雜草生長(zhǎng)而不影響大豆生長(zhǎng)?？钩輨┐蠖笲PS-CV127-9主要在巴西種植，中國(guó)是巴西大豆的主要進(jìn)口國(guó)家之一Ο
[0004]2013年農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)抗除草劑大豆BPS-CV127-9可進(jìn)口用作加工原料，為了對(duì)抗除草劑大豆BPS-CV127-9的流通進(jìn)行規(guī)范管理，建立有效的轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127-9的檢測(cè)方法與體系，對(duì)轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度的實(shí)施和安全性評(píng)價(jià)具有十分重要的意義。
[0005]目前，轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)方法主要有以下2類:
1)基于蛋白質(zhì)的檢測(cè)，現(xiàn)在應(yīng)用最廣的是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)以及Westernblot的檢測(cè)方法，這類方法要求高質(zhì)量、高特異性的抗體，否則會(huì)影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性，檢測(cè)的靈敏度較低；
2)基于DNA的檢測(cè)，主要是針對(duì)轉(zhuǎn)基因作物中的外源插入基因進(jìn)行檢測(cè)，主要有分子雜交技術(shù)、PCR檢測(cè)技術(shù)和芯片檢測(cè)技術(shù)，其中PCR檢測(cè)方法是最主要、最準(zhǔn)確的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物的方法，但這類方法的反應(yīng)體系和操作過程比較復(fù)雜，需要專業(yè)人員；需要特定的PCR儀，擴(kuò)增時(shí)間2?3小時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果需要進(jìn)行終產(chǎn)物檢測(cè)如電泳；電泳常用染料如EB等有較強(qiáng)毒性，且難以實(shí)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。定量PCR檢測(cè)靈敏度高，所使用的熒光種類主要Taqman探針、SYBR Green I和分子信標(biāo)，隨著反應(yīng)進(jìn)行，體系中產(chǎn)生的焚光信號(hào)值隨之增大。其他兩種方法較SYBR GreenI染料法靈敏度相對(duì)較高，但是熒光定量PCR儀器成本較大。
[0006]綜上所述，在生產(chǎn)實(shí)踐中均需要一種快速、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、容易普及、安全可靠且適用于現(xiàn)場(chǎng)操作的轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)方法。
[0007]環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)(Loop-MediatedIsothermal Amplificat1n，以下簡(jiǎn)稱LAMP法)是Notomi和0kayama2000年前后開發(fā)出的基因擴(kuò)增技術(shù)，其具有快速簡(jiǎn)便、操作準(zhǔn)確、容易普及、安全可靠的優(yōu)點(diǎn)，目前尚未有將恒溫?cái)U(kuò)增目視檢測(cè)技術(shù)、恒溫實(shí)時(shí)熒光技術(shù)應(yīng)用于快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127-9及其衍生品種的試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127-9的LAMP檢測(cè)引物組、LAMP檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問題。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127-9及其衍生品種的LAMP檢測(cè)引物組，包括外引物1和外弓丨物2、內(nèi)引物1和內(nèi)引物2，其核苷酸序列分別如下所示:
外引物1:TGTTTGGAAGCTTGAAACG(SEQ ID No:l)；
外引物2:GATCGGGTTTGTGACAGC(SEQ ID No:2)；
內(nèi)引物1:CGGAATTGGTAATCGAAATTAGGGTGGGCAAACTAGTCTCGTAA(SEQ ID No:3)；
內(nèi)引物2:AAGAAGTCATGGAAGCCATTGATTCGAGACGAACACTGCTCTTA(SEQ ID No:4)。
[0010]轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127-9及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒，包括以下成分:
(1)引物液:含有上述的轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127-9及其衍生品種的LAMP檢測(cè)引物組，所述引物液中各引物的濃度分別為48?52μΜ外引物1、48?52μΜ外引物2，48?52μΜ內(nèi)引物1、48?52μΜ內(nèi)引物2;
(2)反應(yīng)液:含有12mM dNTPs、10 X Isothermal Amplificat1n反應(yīng)緩沖液、150mMMgS04水溶液，所述dNTPs、反應(yīng)緩沖液和MgS04水溶液的體積比是7?9:4?6:2;
(3)DNA聚合酶:DNA聚合酶的濃度為7?9UAU;
(4)對(duì)照:陽(yáng)性對(duì)照為轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127-9及其衍生品種的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，陰性對(duì)照為不含目的基因的反應(yīng)混合液。
[0011]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述引物液中含有50μΜ外引物1、50μΜ外引物2，50μΜ內(nèi)引物1、50μΜ內(nèi)引物2。
[0012]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶的濃度為8υ/μ1。
[0013]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述反應(yīng)液中，1 2mM dNTP: 10 X IsothermalAmp 1 if i cat 1n反應(yīng)緩沖液:150mM MgS(k水溶液的體積比為8:5:2。
[0014]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:還含有顯色劑，所述顯色劑為熒光染料Calcein。
[0015]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:還含有熒光指示劑，所述熒光指示劑為SYT0-9。
[0016]利用轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127-9及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127-9及其衍生品種的檢測(cè)方法，包括如下步驟:
1)待檢樣品DNA的提取:采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127_9及其衍生品種純化樣品DNA;
2)恒溫檢測(cè)反應(yīng):在PCR管中配制反應(yīng)體系:弓I物液1.8μ1，反應(yīng)液15.2μ1，DNA聚合酶1μ1，待檢DNA 1 ?6μ1，用DNase/RNase-Free Distilled Water補(bǔ)齊到25μ1;設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127-9及其衍生品種的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA;將配制好的PCR管混勾后離心，并于60?65°C反應(yīng)45?90min，并在80°C條件下持續(xù)2min;
3)結(jié)果判斷:通過觀察PCR管內(nèi)沉淀的濁度變化來判斷擴(kuò)增結(jié)果。
[0017]利用轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127-9及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127-9及其衍生品種的檢測(cè)方法，包括如下步驟:
1)待檢樣品DNA的提取:采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127_9及其衍生品種純化樣品DNA;
2)恒溫檢測(cè)反應(yīng):在200μ1PCR管中配制反應(yīng)體系:引物液1.8μ1，反應(yīng)液15.2yl，DNA聚合酶Ιμ?，待檢DNA 1 ?6μ1，用DNase/RNase-Free Distilled Water補(bǔ)齊到25μ1;設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127-9及其衍生品種的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA;將配制好的PCR管混勻后離心，并于60?65°C反應(yīng)45?90min，并在80°C條件下持續(xù)2min；
3)結(jié)果判斷:在上述PCR管中加入1?2μ1顯色劑，混勻，根據(jù)顯色結(jié)果來判斷擴(kuò)增結(jié)果。
[0018]利用轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127-9及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127-9及其衍生品種的檢測(cè)方法，包括如下步驟:
1)待檢樣品DNA的提取:采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127_9及其衍生品種純化樣品DNA;
2)恒溫檢測(cè)反應(yīng):在200μ1PCR管中配制反應(yīng)體系:引物液1.8μ1，反應(yīng)液15.2 μΙ,?ΝΑ聚合酶Ιμ?，熒光指示劑SYT0-9 Ιμ?，待檢DNA 1 ?6μ1，用DNase/RNase-Free DistilledWater補(bǔ)齊到25μ1;設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127-9及其衍生品種的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA;將配制好的PCR管混勻后離心，并于實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀在60?65°C反應(yīng)45?90min，并在80°C條件下持續(xù)2min ；
3)結(jié)果判斷:根據(jù)是否出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線判斷擴(kuò)增結(jié)果。
[0019]其中，CTAB法提取轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆BPS-CV127-9及其衍生品種的DNA的方法為:
(1)取轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788約lOOmg，放入研缽中，加入少量液氮迅速磨碎，液氮反復(fù)研磨3次；
(2)加入1.5ml 預(yù)熱至65°C的CTAB提取緩沖液(lOOmM Tris_HCI( pH 8.0)，1.4ΜNaCI,20mM EDTA pH 8.0 )，加入巰基乙醇20μ1，上下震蕩，充分混合，65°C保溫30min，每隔lOmin顛倒混勾一次；
(3)約12000rpm離心lOmi