一種雞基因agk甲基化檢測方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種雞基因 AGK甲基化檢測方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞腸炎沙門氏菌病是家禽生產(chǎn)中的常見疾病，腸炎沙門氏菌能夠透過蛋殼進(jìn)入雞 蛋產(chǎn)品中，且能在生殖道中寄存繁殖。之前有報(bào)道，美洲等發(fā)達(dá)國家中發(fā)生的食物中毒事 件，大多數(shù)是由禽類的沙門氏菌而引起的，而其中，起主要作用的病原就是腸炎沙門氏菌。 腸炎沙門氏菌對家禽生產(chǎn)造成重大影響，引起畜禽發(fā)病，而且是食源性致病菌，能通過家禽 副產(chǎn)品給人類的健康帶來很大的威脅，是報(bào)道最頻繁的致病微生物之一。
[0003] AGK基因在疾病中尤其是癌癥中具有重要的調(diào)控作用，已有研究證明AGK基因在各 種腫瘤中例如前列腺癌、食道鱗狀癌癥、卵巢癌、胃癌、乳癌等中表達(dá)上調(diào)。此外，AGK基因能 作為肝細(xì)胞癌一個(gè)新的藥物作用靶點(diǎn)。到目前為止，尚未有關(guān)于AGK基因在雞腸炎沙門氏菌 感染中發(fā)揮的甲基化調(diào)控作用的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的發(fā)明人針對上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，結(jié)合長期研究和探索，提供了一種雞 基因 AGK甲基化檢測方法及其應(yīng)用，該方法提供了雞基因 AGK甲基化檢測的特異性引物及配 合該引物使用的巢式PCR條件，利用上述引物和方法，可以準(zhǔn)確檢測雞感染腸炎沙門氏菌后 AGK基因中的甲基化情況，并可以以此作為分子標(biāo)記為雞抗腸炎沙門氏菌感染提供理論依 據(jù)。
[0005] 發(fā)明人提供的具體技術(shù)方案如下：
[0006] -種雞基因 AGK甲基化檢測方法，所采用的方法為巢式PCR，所采用的雞AGK基因特 異性的甲基化引物，其序列如下表所示：
[0007]
[0008] 上述引物前一對為第一對引物，后一對為第二對引物，利用上述2對特異性引物對 經(jīng)亞硫酸鹽對修飾處理后的雞的全基因組基因 DNA進(jìn)行巢式PCR，2次反應(yīng)條件一致，其PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系如下，每20yL體系為：
[0009]

[0010] PCR擴(kuò)增條件為：
[0011]
[0012] 其中所述的亞硫酸鹽修飾處理采用QIAGEN公司甲基化修飾試劑盒對雞基因組DNA 進(jìn)行亞硫酸鹽修飾處理，使未發(fā)生甲基化的胞嘧啶位置轉(zhuǎn)換成尿嘧啶，而發(fā)生甲基化位點(diǎn) 因5'-甲基胞嘧啶的保護(hù)而不發(fā)生變化。
[0013] 而上述的PCR擴(kuò)增條件也根據(jù)本發(fā)明的目的進(jìn)行了對應(yīng)調(diào)整，是在眾多備選條件 中優(yōu)選出的最佳條件，可配合本發(fā)明的特異性引物起到最佳的檢測效果。
[0014] 所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行大腸桿菌克隆，轉(zhuǎn)化成功后直接進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示， 腸炎沙門氏菌感染后AGK基因中所檢測各CpG位點(diǎn)的甲基化受到抑制，利用這一特性，可以 作為腸炎沙門氏菌感染的甲基化分子標(biāo)記。
[0015] 基于上述理由，利用本發(fā)明所述的雞基因 AGK甲基化檢測方法檢測待測雞群，可以 作為雞抗腸炎沙門氏菌感染提供可靠的依據(jù)，并將其應(yīng)用與養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中。
[0016] 綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人首次提供了一種雞基因 AGK甲基化檢測方法及其應(yīng)用， 該方法提供了雞基因 AGK甲基化檢測的特異性引物及配合該引物使用的巢式PCR條件，利用 上述引物和方法，可以準(zhǔn)確檢測雞感染腸炎沙門氏菌后AGK基因中的甲基化情況，并可以以 此作為分子標(biāo)記為雞抗腸炎沙門氏菌感染提供理論依據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下述實(shí)施例中除特殊說明之外，所采用的均為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；
[0018] 實(shí)施例1
[0019] -種雞基因 AGK甲基化檢測方法，所采用的方法為巢式PCR，所采用的雞AGK基因特 異性的甲基化引物，其序列如下表所示：
[0020]
[0021]選擇腸炎沙門氏菌陰性的壽光雞6-10只，試驗(yàn)組口服接種含菌量為109cfu的腸炎 沙門氏菌菌液0.3mL，對照組接種0.3mLPBS緩沖液，接種后14日采集盲腸樣品，提取基因組 DNA，試驗(yàn)組和對照組各取3-5只。
[0022] 用QIAGEN公司甲基化修飾試劑盒對雞基因組DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾處理，使未發(fā) 生甲基化的胞嘧啶位置轉(zhuǎn)換成尿嘧啶，而發(fā)生甲基化位點(diǎn)因甲基胞嘧啶的保護(hù)而不發(fā) 生變化。
[0023] 上述引物前一對為第一對引物，后一對為第二對引物，利用上述2對特異性引物對 上述經(jīng)亞硫酸鹽對修飾處理后的雞的全基因組基因 DNA進(jìn)行巢式PCR，2次反應(yīng)條件一致，其 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下，每20yL體系為：
[0024]
[0025]
[0026] PCR擴(kuò)增條件為：
[0027]
[0028] 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行大腸桿菌克隆，轉(zhuǎn)化成功后直接進(jìn)行，測序檢測發(fā)生甲基化的CpG位 點(diǎn)數(shù)量，測序結(jié)果顯示AGK基因發(fā)生甲基化的CpG位點(diǎn)數(shù)量如下表：
[0029]表1AGK基因發(fā)生甲基化的CpG位點(diǎn)數(shù)量
[0030]
[0031] 結(jié)果顯示對照組發(fā)生甲基化的CpG位點(diǎn)的個(gè)數(shù)為150個(gè)，處理組為129個(gè)，對照組顯 著多于處理組。進(jìn)一步比較每一個(gè)CpG位點(diǎn)在對照組與處理組中發(fā)生甲基化的百分比情況， 結(jié)果如下表所示，在檢測到的7個(gè)CpG位點(diǎn)中，受腸炎沙門氏菌的影響，只有在CpG2對照組的 甲基化是小于處理組，其余6個(gè)位點(diǎn)均為對照組大于處理組。
[0032] 表4對照組與處理組甲基化CpG位點(diǎn)百分比
[0033]
[0034] 可見腸炎沙門氏菌感染后AGK基因中所檢測各CpG位點(diǎn)的甲基化受到抑制，因此可 以作為腸炎沙門氏菌感染的甲基化分子標(biāo)記，為雞抗腸炎沙門氏菌感染提供理論依據(jù)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種雞基因AGK甲基化檢測方法，其特征在于:所采用的方法為巢式PCR，所采用的雞 AGK基因特異性的甲基化引物，其序列如下表所示：上述引物前一對為第一對引物，后一對為第二對引物，利用上述2對特異性引物對經(jīng)亞 硫酸鹽修飾處理后的雞的全基因組基因DNA進(jìn)行巢式PCR，兩次反應(yīng)條件一致，其PCR擴(kuò)增反 應(yīng)體系如下，每20yL體系為：所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行大腸桿菌克隆，轉(zhuǎn)化成功后直接進(jìn)行測序，以確定甲基化是否 受到抑制； 其中所述的亞硫酸鹽修飾處理采用QIAGEN公司甲基化修飾試劑盒對雞基因組DNA進(jìn)行 亞硫酸鹽修飾處理，使未發(fā)生甲基化的胞嘧啶位置轉(zhuǎn)換成尿嘧啶，而發(fā)生甲基化位點(diǎn)因5^ 甲基胞嘧啶的保護(hù)而不發(fā)生變化。2. 權(quán)利要求1所述的雞基因AGK甲基化檢測方法在雞抗腸炎沙門氏菌感染中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種雞基因AGK甲基化檢測方法及其應(yīng)用，該方法提供了雞基因AGK甲基化檢測的特異性引物及配合該引物使用的巢式PCR條件，利用上述引物和方法，可以準(zhǔn)確檢測雞感染腸炎沙門氏菌后AGK基因中的甲基化情況，并可以以此作為分子標(biāo)記為雞抗腸炎沙門氏菌感染提供理論依據(jù)。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105483264
【申請?zhí)枴緾N201610016846
【發(fā)明人】李顯耀, 王莎莎, 吳桂賢, 王巧巧
【申請人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2016年1月11日