一種腸道病毒三重直接熒光rt-pcr的檢測試劑盒和反應體系的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及腸道病毒的分子生物學檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腸道病毒通用 型、CA16型、EV71型三重直接熒光RT-PCR的檢測試劑盒和反應體系。
【背景技術(shù)】
[0002] 手足口病(Hand，foot，and mouth disease，HFMD)是一種腸道病毒引起的傳染病， 多發(fā)于學齡前兒童，可引起患兒手、足、口腔等部位的皰疹，少數(shù)患兒可引起心肌炎、肺水 月中、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥，重癥患兒死亡率較高。引起手足口病的病原主要為腸道病毒 屬的柯薩奇病毒(Coxasckie virus)A組16、4、5、7、9、10型，13組2、5、13型；?？刹《?ECHO viruses)、腸道病毒通用型和腸道病毒71型(EV71型），其中以EV71型及CA16型最為常見。
[0003] 目前，腸道病毒感染的特異性診斷技術(shù)包括病原學、免疫學、分子生物學三個方面 五種方法，即病毒分離鑒定、血清學檢測技術(shù)、免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)以及反轉(zhuǎn) 錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。病毒分離鑒定、血清學檢測技術(shù)、免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附 (ELISA)診斷技術(shù)存在耗時長、敏感性較低、不易標準化等缺點，在實際應用中具有一定的 局限性，無法滿足大量樣本的快速診斷。
[0004] 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)的檢測技術(shù)需要提取病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再 進行PCR擴增和后續(xù)產(chǎn)物處理，在處理痕量樣本上，提取病毒RNA過程容易發(fā)生RNA降解或交 叉污染等事件，仍存在較大困難，無法做到高通量、低成本、高效率的方法來進行批量的快 速檢測?；趥鹘y(tǒng)熒光RT-PCR檢測腸道病毒的方法在操作步驟、靈敏度及特異性等方面還 有待于改進和發(fā)展。
[0005] 為了提高腸道病毒感染檢測效率、節(jié)省成本、避免交叉污染并進行高通量檢測，一 種較好的解決方案是設(shè)法實現(xiàn)腸道病毒通用型、CA16型、EV71型直接擴增的RT-PCR檢測，即 直接以采集的液體樣本作為檢測對象進行RT-PCR反應，同時檢測腸道病毒通用型、CA16型、 EV71型。然而，受限于引物和探針易受樣本復雜因素的影響，以及引物和探針易形成復雜結(jié) 構(gòu)而導致互相干擾等因素的影響，目前還沒有合適的引物和探針可以用于高效地實現(xiàn)上述 目的。
[0006] 此外，目前也缺乏合適的反應液用于實現(xiàn)腸道病毒通用型、CA16型、EV71型三重直 接擴增的RT-PCR檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種腸道病毒通用型、CA16型、EV71型三重直接熒光RT-PCR的檢測試 劑盒和反應體系。將本發(fā)明的試劑盒用于腸道病毒的檢測中，可以直接將樣本加入反應管 內(nèi)進行檢測，而不需要純化RNA這一繁瑣的步驟，減少了操作步驟，可以快速、準確檢測腸道 病毒通用型，縮短檢測時間，提高檢測效率，節(jié)省成本，同時可以有效地降低交叉污染的風 險。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種腸道病毒通用型、CA16型、EV71型三重直 接熒光RT-PCR的檢測試劑盒，包括：
[0009] 兩條用于檢測腸道病毒通用型的引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2;-條用于檢測腸道病毒通用型的探針，其堿基序列為SEQ ID NO:3;其中SEQ ID NO:3 的5 '端標記有熒光報告基團，3 '端標記有熒光淬滅基團；
[0010] 兩條用于檢測腸道病毒CA16型的引物，其堿基序列分別為SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5; -條用于檢測腸道病毒CA16型的探針，其堿基序列為SEQ ID N0:6;其中SEQ ID N0:6 的5 '端標記有熒光報告基團，3 '端標記有熒光淬滅基團；
[0011] 兩條用于檢測腸道病毒EV71型的引物，其堿基序列分別為SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8; -條用于檢測腸道病毒EV71型的探針，其堿基序列為SEQ ID NO:9;其中SEQ ID NO:9 的5 '端標記有熒光報告基團，3 '端標記有熒光淬滅基團。
[0012] 作為本發(fā)明的進一步改進的方案，上述探針SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:9的焚光報告基團互不相同。
[0013] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述探針SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:9的熒 光報告基團分別為R〇X、HEX和FAM。
[0014] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述探針SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:9的熒 光淬滅基團分別為BHQ2、BHQ1和BHQ1。
[0015] 作為本發(fā)明的進一步改進的方案，上述試劑盒還包括：
[0016] 兩條用于檢測內(nèi)標的引物，其堿基序列分別為SEQ ID N0:10和SEQ ID N0:11; - 條用于檢測內(nèi)標的探針，其堿基序列為SEQ ID NO: 12;其中SEQ ID NO: 12的5'端標記有熒 光報告基團，3 '端標記有熒光淬滅基團；
[0017]內(nèi)標，其為RNA分子，含有內(nèi)標擴增所需的序列，其對應的DNA堿基序列為SEQ ID N0：13〇
[0018]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述探針SEQ ID NO: 12的熒光報告基團不同于上述探針 SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:9的熒光報告基團，更優(yōu)選上述探針SEQ ID N0:12 的熒光報告基團為CY5,且上述探針SEQ ID NO: 12的熒光淬滅基團為BHQ2。
[0019]作為本發(fā)明的進一步改進的方案，上述試劑盒還包括:直接RT-PCR反應液，該直接 RT-PCR反應液包括Tri s-HCl、硫酸銨、氯化鉀、Tri ton X-100、氯化鎂、dNTPs混合物和PCR增 強劑。
[0020] 作為本發(fā)明的更進一步改進的方案，在上述直接RT-PCR反應液中，Tris-HCl的濃 度為20mmol/L~110mmol/L;硫酸銨的濃度為10mmol/L~40mmol/L;氯化鉀的濃度為 60111111〇1/1~120111111〇1/1 ;1^如11父-100的體積百分含量為0.02%~3%;氯化鎂的濃度為 4_〇1凡~1〇1111]1〇1凡;(11^1 ：)8混合物中每種(11^1：)的濃度為2.5_〇1凡~5_〇1凡;？0?增強劑的 濃度為 2mmol/L ~10mmol/L。
[0021] 作為本發(fā)明的進一步改進的方案，上述PCR增強劑選自甜菜堿(Betaine)、四甲基 氯化銨（Tetramethylammonium chloride，TMAC)、肉喊（L-carnitine)、海藻糖（D_( + )_ trehalose)和非離子去污劑NP_40中的一種或多種。
[0022] 作為本發(fā)明的進一步改進的方案，上述試劑盒還包括:酶混合液，該酶混合液包 括:高耐受性Taq DNA聚合酶、耐熱型M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑和酶保存液。優(yōu)選地，該 酶混合液按照高耐受性Taq DNA聚合酶酶活力20U~80U，耐熱型M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶酶活力25U ~100U，RNA酶抑制劑酶活力1U~50U混合形成，其余為酶保存液。
[0023] 作為本發(fā)明的進一步改進的方案，上述試劑盒還包括:樣本采集液，上述樣本采集 液為不含1丐鎂離子的HBSS緩沖液(Hank's Balanced Salt Solution，Hank's平衡鹽溶液）。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種腸道病毒通用型、CA16型、EV71型三重直 接熒光RT-PCR的檢測反應體系，包括 :SEQIDN0:1、2、4、5、7、8、10、11所示的引物，SEQID NO: 3、6、9、12所示的探針，以及含有SEQ ID NO: 13所示的DNA堿基序列的內(nèi)標RNA分子，還含 有直接RT-PCR反應液、酶混合液和樣本采集液，其中直接RT-PCR反應液包括Tr i s-HCl、硫酸 銨、氯化鉀、Triton X-100、氯化鎂、dNTPs混合物和PCR增強劑;上述酶混合液包括高耐受性 Taq DNA聚合酶、耐熱型M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑和酶保存液;其中在上述反應體系中， Tris-HCl 的濃度為9 · 6mmol/L~52 · 8mmol/L;硫酸錢的濃度為4 · 8mmol/L~19 · 2mmol/L;氣 化鉀的濃度為28 · 8mmol/L~57 · 6mmol/L; Triton X-100的體積百分含量為0 · 0096 %~ 1.44%;氯化鎂的濃度為1.92mmol/L~4.8mmol/L，dNTPs混合物中每種dNTP的濃度為 1 · 2mmol/L ~2 · 4mmol/L，PCR 增強劑的濃度為