β-內(nèi)酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及β-內(nèi)酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物，還 涉及β-內(nèi)酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的機(jī)制有多種，其中β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是最重要 和最常見(jiàn)的機(jī)制，其通過(guò)與內(nèi)酰胺環(huán)上的羰基共價(jià)結(jié)合，水解酰胺鍵使內(nèi)酰胺類抗菌 藥物失活。近年來(lái)，隨著超廣譜內(nèi)酰胺類抗菌藥物的大量應(yīng)用，內(nèi)酰胺酶的種類、底物 譜及耐藥程度以驚人的速度發(fā)展，已經(jīng)使細(xì)菌對(duì)氨曲南、絕大多數(shù)第三代頭孢菌素甚至第 四代頭孢菌素耐藥。解決上述問(wèn)題的主要方法之一是開(kāi)發(fā)內(nèi)酰胺酶抑制劑。目前臨床廣 泛應(yīng)用的內(nèi)酰胺酶抑制劑有克拉維酸、舒巴坦和三唑巴坦等，它們通過(guò)抑制內(nèi)酰胺酶 的活性而達(dá)到保護(hù)內(nèi)酰胺類抗菌藥物的目的。但隨著這些內(nèi)酰胺酶抑制劑的廣泛應(yīng) 用，對(duì)這些β-內(nèi)酰胺酶抑制劑耐藥的產(chǎn)酶菌也逐漸增加。因此，開(kāi)發(fā)新型、高效的其它β-內(nèi) 酰胺酶抑制劑很有必要。
[0003] β-內(nèi)酰胺酶抑制蛋白（β-lactamase inhibitory protein，BLIP)是 1990年從土壤 棒狀鏈霉菌培養(yǎng)液中分離得到的主要蛋白質(zhì)。文獻(xiàn)報(bào)道，BLIP的2個(gè)折疊區(qū)域能夠插入β-內(nèi) 酰胺酶的活性位點(diǎn)中，阻止內(nèi)酰胺酶與內(nèi)酰胺類抗菌藥物的接合。雖然BLIP由165個(gè)氨 基酸組成，分子量較大，抗原性較強(qiáng)，不適合開(kāi)發(fā)成為臨床使用的藥物，但其為β-內(nèi)酰胺酶 抑制肽的研究和開(kāi)發(fā)提供了新的途徑。公開(kāi)號(hào)為CN1778916A的中國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種能 夠抑制內(nèi)酰胺酶的多肽。該多肽由24個(gè)氨基酸組成，推測(cè)分子量為2600道爾頓，雖然與 BLIP相比在分子量、抗原性方面具有一定優(yōu)勢(shì)，但仍然存在分子量較大及潛在的抗原性等 問(wèn)題；同時(shí)該多肽采用大腸桿菌表達(dá)制備，工藝復(fù)雜，周期長(zhǎng)，耗資大，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。 李勇湧等(β_內(nèi)酰胺酶抑制肽的活性研究.中國(guó)抗生素雜志，2010,35(4):300-304)通過(guò)計(jì) 算機(jī)分子三維模擬設(shè)計(jì)并合成了 6個(gè)β-內(nèi)酰胺酶抑制肽(各抑制肽的氨基酸序列未公開(kāi)）， 但在鑒定活性的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，抑制肽②和⑤無(wú)法溶解，抑制肽④在保存過(guò)程中大部分已降 解，剩下的3個(gè)抑制肽雖然具有β-內(nèi)酰胺酶抑制活性，但活性均較弱。陳勇川等在申請(qǐng)?zhí)枮?CN102212110A公開(kāi)了β-內(nèi)酰胺酶抑制肽具有較強(qiáng)的β-內(nèi)酰胺酶抑制活性，且分子量小，不 易產(chǎn)生抗原性，但其在體內(nèi)易被水解酶水解，半衰期短，為維持一定的療效需要大劑量反復(fù) 用藥。因此，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶抑制肽進(jìn)行化學(xué)修飾，增加其穩(wěn)定性，改變其在人體內(nèi)的生物學(xué) 分布，延長(zhǎng)其半衰期是十分必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供β-內(nèi)酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物； 本發(fā)明的目的之二在于提供內(nèi)酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物在制備內(nèi)酰胺酶抑 制劑中的應(yīng)用;本發(fā)明的目的之三在于提供內(nèi)酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物與內(nèi) 酰胺類抗菌藥物聯(lián)合在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0006] β-內(nèi)酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物，所述β-內(nèi)酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍 生物為β-內(nèi)酰胺酶抑制肽的氨基端修飾Nh 2-(Ch2CH2O)8-CH2CH 2COOH的化合物，所述β-內(nèi)酰 胺酶抑制肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 優(yōu)選的，所述β-內(nèi)酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物的結(jié)構(gòu)式如下：
[0009] 2、所述β_內(nèi)酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物在制備β_內(nèi)酰胺酶抑制劑中的應(yīng) 用。
[0010] 3、所述β-內(nèi)酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物聯(lián)合用于 制備抗菌藥物中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明提供了一種β-內(nèi)酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生 物，可通過(guò)固相多肽合成法制備，簡(jiǎn)便易行、生產(chǎn)成本低，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn);不易被水 解酶水解，體內(nèi)半衰期長(zhǎng);可用于制備β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物聯(lián)用以提 高β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的抗菌療效，在細(xì)菌感染治療領(lǐng)域具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0013] 圖1為β-內(nèi)酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物高效液相圖。
[0014] 圖2為β-內(nèi)酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物質(zhì)譜圖。
[0015] 圖3為β-內(nèi)酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的抑制活性測(cè)定結(jié) 果。
[0016] 圖4為β-內(nèi)酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物和β-內(nèi)酰胺酶抑制肽的藥時(shí)曲線 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0018] 實(shí)施例1、固相多肽合成法制備β-內(nèi)酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物
[0019 ]固相多肽合成法制備β_內(nèi)酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物，具體步驟如下：
[0020] (1)樹(shù)脂溶漲:將王樹(shù)脂(wang resin)放入反應(yīng)管中，加 N，N-二甲基甲酰胺(DMF)， 振蕩30min;
[0021] (2)接第一個(gè)氨基酸:通過(guò)沙芯抽濾掉溶劑，加入相當(dāng)于合成多肽3倍摩爾的Fmoc-〇-叔丁基-L-酪氨酸(Fmoc-L-Tyr(Tbu)-OH)，再加入相當(dāng)于合成多肽10倍摩爾的4-二甲氨 基吡啶(DMAP)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，最后加入DMF溶解，振蕩30min，用醋酸酐封閉； [0022] (3)脫保護(hù):去掉DMF，加體積分?jǐn)?shù)為20 %的哌啶DMF溶液，5min后去掉，再加體積分 數(shù)為20%的哌啶DMF溶液，15min;
[0023] (4)檢測(cè)：抽掉哌啶溶液，取十幾粒樹(shù)脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，氰化鉀，苯酚 溶液各一滴，105-110°C加熱5min，變深藍(lán)色為陽(yáng)性反應(yīng)；
[0024] (5)清洗:用DMF、甲醇、DMF各洗兩次；
[0025] (6)縮合:將相當(dāng)于合成多肽3倍摩爾的保護(hù)氨基酸，相當(dāng)于合成多肽3倍摩爾的0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)，用DMF溶解，加入反應(yīng)管，立刻加入相當(dāng)于合成多 肽10倍摩爾的4-甲基嗎啉(NMM)反應(yīng)30min;
[0026] (7)清洗:依次采用DMF (I Oml /g)洗一次，甲醇（I Oml /g)洗兩次，DMF (I Oml /g)洗兩 次；
[0027] (8)重復(fù)2至6步操作，按照序列C端到N端殘基順序依次合成序列如下氨基酸:Thr Thr Trp Ser Glu Tyr Tyr Pro Ala Tyr；
[0028] (9)直線肽完成后質(zhì)譜檢測(cè)直線肽為主峰對(duì)，加入相當(dāng)于合成多肽2倍摩爾的NH2-(CH2CH 20)8-CH2CH2C00H，相當(dāng)于合成多肽3倍摩爾的HBTU，利用DMF溶解，立刻加入相當(dāng)于合 成多肽10倍摩爾的NMM反應(yīng)30min;按步驟(4)的方法進(jìn)行檢測(cè)，顯色為無(wú)色，去除Fmoc保護(hù) 基；
[0029] (10)抽干，按照下列方法洗樹(shù)脂：依次采用DMF(IOmVg)洗兩次，甲醇（IOmVg)洗 兩次，DMF( 10ml/g)洗兩次，DCM( 10ml/g)洗兩次，抽干 IOmin;
[0030] (11)從樹(shù)脂上切割多肽:配制切割液（IOmVg)三氟乙酸95%(V/V);水2%(V/V); 1，2-乙二硫醇2%(￥八〇;三異丙基硅烷1%(￥八〇;在切割液作用下切割12〇1^11。
[0031] (12)吹干洗滌:將裂解液用氮?dú)獗M量吹干，用乙醚洗六次，然后常溫(25°C)揮干； [0032] (13)將干粉狀多肽粗品，采用高效液相色譜法進(jìn)行純化(SMMADZU高效液相色譜 儀，Kromasil 20 X 250mm C18120A色譜柱，流動(dòng)相由體積分?jǐn)?shù)為0.1 %的三氟乙酸和乙腈按 照體積比為50:50混合而成），即得β-內(nèi)酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物純品，結(jié)構(gòu)如式I 所示。
[0034]式 1
[0035]經(jīng)高效液相色譜法鑒定，結(jié)果如圖1所示，結(jié)果顯示獲得的β_內(nèi)酰胺酶抑制肽的聚 乙二醇化衍生物純品純度大于98%;經(jīng)質(zhì)譜法鑒定，結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明β-內(nèi)酰胺酶 抑制肽的聚乙二醇化衍生物純品分子量與理論分子量一致。
[0036]實(shí)施例2、β_內(nèi)酰胺酶粗提液的制備及活性鑒定
[0037]挑取臨床分離并經(jīng)Nitrocef ?η(β-內(nèi)酰胺酶特異性鑒定試劑）鑒定的產(chǎn)β-內(nèi)酰胺 酶的肺炎克雷伯菌單菌落，接種于5ml新鮮肉湯中，37°C孵育24小時(shí)，再吸取該培養(yǎng)液2ml加 入200ml新鮮肉湯中，37°C振蕩孵育24小時(shí)，4°C、5000Xg離心30分鐘，收集菌體，用0.05M、 PH7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體2次，再用該緩沖液5ml重懸菌體，冰水浴條件下超聲破碎菌 體，4°C、20000 X g離心1小時(shí)，收集上清液，即得β-內(nèi)酰胺酶粗提液，經(jīng)蛋白定量后置-70°C 冰箱中保存。
[0038]向終濃度為HT4M的頭孢噻啶溶液3ml中加入β-內(nèi)酰胺酶粗提液30μ1，37°C混勻，立 即用紫外分光光度