一種桿菌肽及其鋅鹽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種桿菌肽及其鋅鹽桿菌肽鋅的制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 桿菌肽(Bacitracin)最初是Johnson從患者傷口污染物中分離出的一株枯草芽孢 桿菌，經(jīng)培養(yǎng)得到的多肽類抗生素。可由枯草芽孢桿菌(baciIlus sabtiI is)和地衣芽孢桿 菌(Baci Ilus Iicheniformis)產(chǎn)生。由于其對革蘭氏陽性菌有較強的抗菌作用，與金屬離 子絡(luò)合后穩(wěn)定性增強，抗菌活性更高。該藥局部應(yīng)用刺激小，過敏反應(yīng)少見，耐酶，細菌對其 產(chǎn)生耐藥性又較慢，獲得耐藥性菌株極為罕見。而且其活性不受膿液、痰液、血液、滲出液和 壞死組織的影響，故迄今常作為局部抗感染藥而廣泛使用。
[0003] 桿菌肽是由12個氨基酸組成的多肽類抗生素，其中含有一個7個氨基酸構(gòu)成的環(huán) 肽。桿菌肽中含有桿菌肽A、B、C、D、E、F、G等多個組分，其中桿菌肽A生物活性最強。
[0004] 美國藥典對藥用桿菌肽各組分含量有嚴(yán)格的規(guī)定;其中桿菌肽A(HPLC相對保留時 間為1.0RT)含量不小于40%，桿菌肽BI、B2、B3、A(0.7RT，0.7RT，0.8RT，1.0RT)的峰面積之和 不小于70%，桿菌肽BU0.7RT)之前的峰面積之和不得大于20%，桿菌肽F(2.4RT)的峰面積不 大于6%。
[0005] 桿菌肽為多組分產(chǎn)品，美國藥典對各組分含量有嚴(yán)格的規(guī)定。國內(nèi)產(chǎn)品由于達不 到國外藥典標(biāo)準(zhǔn)多為獸用制品，本產(chǎn)品的提取技術(shù)路線國內(nèi)研究很少，郭淑琴、魏景新發(fā)表 的《樹脂吸附法提取桿菌肽的研究》(沈陽化工1985.03.02)，使用離子交換法提純桿菌肽， 可得到純度54U/mg的桿菌肽，天津大學(xué)化工學(xué)院研究生劉詠的論文《抗生素桿菌肽鋅脫色 提純工藝研究》利用膜分離技術(shù)對桿菌肽鋅鹽進行純化精制，最終可使產(chǎn)品效價提高到 50U/mg以上。這兩種方法所獲得產(chǎn)品的生物活性均不是很高。
[0006] 國外對該產(chǎn)品純化工藝研究較多，US2,457,887以活性氧化鋁或活性炭吸附桿菌 肽進行提取，由于無機介質(zhì)對活性物質(zhì)的吸附量很低，該法不適合工業(yè)化。US2，498，165和 US2，609，324使用大量有機溶劑多級萃取，有些溶劑毒性較大，該法收率較低，純化效果也 不明顯。US3,937,694以沉淀法純化桿菌肽，但只提供了制備工藝中某一步的方法，未形成 完整制備藥用產(chǎn)品的工藝。US2，739，063以沉淀劑將桿菌肽沉淀到無機載體上，該法收率較 低，產(chǎn)品穩(wěn)定性差。GB782,999采用羧酸型陽離子交換樹脂提取，解析液經(jīng)溶媒萃取提純后 制備桿菌肽鋅，產(chǎn)品效價可到55U/mg，總收率35%左右，無論產(chǎn)品效價還是總收率均處于較 低水平。US2,915,432使用低交聯(lián)度羧酸型陽離子交換樹脂提取，輔以無機鹽沉淀法純化 制備出高效價桿菌肽鋅總收率51%，產(chǎn)品效價可達76U/mg。該法需要使用大量無機鹽，回收 困難，該法總收率也偏低。
[0007] 因此，如何制備得到桿菌肽以及桿菌肽鋅鹽，工藝簡潔，收率高、低能耗、高活性而 且還要符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，成為發(fā)明人亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、高活性的桿菌肽及其鹽桿菌肽鋅的制備方 法。
[0009] 本發(fā)明所提供的桿菌肽的制備方法，包括以下步驟： 1)吸附：向發(fā)酵液中加入超順磁性微球。
[0010] 2)分離:磁性分離發(fā)酵液中的超順磁性微球，收集分離出的超順磁性微球。
[0011] 3)清洗:用水清洗分離出的超順磁性微球。
[0012] 4)洗脫：以解吸液浸泡分離出的超順磁性微球，收集該解吸液。
[0013] 5)萃取:將解吸液調(diào)PH6.0-8.0后以有機溶劑進行萃取，得桿菌肽萃取液。
[0014] 6)沉淀：向萃取液中加入沉淀劑沉淀，經(jīng)過濾、干燥，得到桿菌肽。
[0015]其中步驟1)所述超順磁性微球的粒徑為1〇-30μπι，粒徑分布為單分散，表面的功能 基團為羧基基團。所述的超順磁性微球的用量為每升發(fā)酵液加入30-50克。
[0016]超順磁性微球預(yù)處理及再生方式為每克微球加入3-5ml的2m〇L/L的HC1，靜態(tài)浸泡 2-4小時后過濾，除去鹽酸，然后用去離子水洗滌至pH值4.0-5.0。
[0017]其中步驟3)所述水為去離子水。
[0018] 其中步驟4)所述解吸液為2-4%氨水，用量為每克超順磁性微球加入3-5毫升。
[0019] 其中步驟5)中所述有機溶劑為正丁醇、異丁醇、乙酸丁酯中的一種，萃取pH為6.0-8.0〇
[0020] 其中步驟6)所述沉淀劑為丙酮，用量為萃取液體積的5-8倍。
[0021] 本發(fā)明還公開了一種由桿菌肽制備桿菌肽鋅的制備方法，所述方法由步驟1)到步 驟5)制得的萃取液加入水，加酸化劑調(diào)節(jié)pH為3.0-5.0,萃取得水相，水相調(diào)節(jié)pH為7.5-9.0，向水相中加入硫酸鋅，得到桿菌肽鋅沉淀，經(jīng)過濾、干燥制得。
[0022] 其中優(yōu)選加酸化劑調(diào)節(jié)pH為3.5-4.0,其中所述酸化劑為鹽酸、草酸、醋酸、硫酸中 任意一種。
[0023] 其中萃取得到的水相調(diào)節(jié)pH為8.0-8.5。
[0024] 本發(fā)明由于超順磁性微球?qū)U菌肽活性組分具有高特異性吸附，對無活性的桿菌 肽F吸附能力很弱，不僅有效除去了微生物發(fā)酵代謝中產(chǎn)生的雜蛋白、色素、多糖等雜質(zhì)，特 別是將難以通過簡單方法去除的雜質(zhì)桿菌肽F含量有效降低，從而大大簡化了提取純化工 藝。該工藝由于操作簡單快捷、處理時間短，有效減少了活性組分的降解，桿菌肽的純度大 幅提高，各種活性組分得到很好的保留，各組分比例達到美國藥典標(biāo)準(zhǔn)。所制備的桿菌肽生 物效價到達78U/mg，桿菌肽鋅生物效價到達76U/mg，桿菌肽鋅總收率可達70%以上。工藝中 所用溶劑毒性小、用量少，易回收利用，方便工業(yè)化生產(chǎn)。 具體實施例
[0025] 下述實例僅用于闡述實現(xiàn)本發(fā)明的方法，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。所有基于 本發(fā)明思路做出的修改和變化都應(yīng)歸于本發(fā)明的保護范圍。
[0026] 實施例中所用的實驗材料如無特殊說明均為工業(yè)級原料;所用的超順磁性微球由 蘇州納微生物科技有限公司提供，所用的棉籽蛋白粉購自青島科瑞，酵母浸提物購自安琪 酵母股份有限公司；分析色譜柱Hypersil GOLD C18,5ym，4.6X250 mm購自迪馬科技有限 公司，提取過程所用有機溶劑購自北京化工廠，酸、堿、硫酸鋅等試劑均為市售。色譜溶劑購 自霍尼韋爾貿(mào)易(上海)有限公司。
[0027] 桿菌肽發(fā)酵液制備方法 地衣芽孢桿菌菌株種子液的制備 將地衣芽孢桿菌菌株的斜面培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基，30°C、200rpm、培養(yǎng)20h獲得種 子液。
[0028] 其中所述的種子培養(yǎng)基按以下方法制得:玉米淀粉5.0克、葡萄糖10.0克、酵母粉 10.0克、硫酸銨2.0克、氯化鈉2.0克、七水硫酸鎂1.5克，加自來水定容至1000mL，pH7.0,121 °C滅菌30分鐘。
[0029]本發(fā)明所述桿菌肽產(chǎn)生菌為編號ATCC 10716的菌株。
[0030]發(fā)酵培養(yǎng)基組成： 玉米淀粉30.0克、葡萄糖20.0克、棉籽蛋白粉15.0克、酵母粉15.0克、硫酸銨2.0克、玉 米漿4.0克、磷酸二氫鉀1.5克、氯化鈉2.5克、七水硫酸鎂2.0克，加自來水定容至IL，pH6.8， 121°C滅菌30min，發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。
[0031 ] 發(fā)酵條件：種子培養(yǎng)20小時后接種，接種量為6%，罐溫29 °C、罐壓0.05 ±0.01 Mpa、通氣比1:1.2 vvm，400 rpm攪拌，發(fā)酵96小時。
[0032]超順磁性微球預(yù)處理及再生 超順磁性微球預(yù)處理及再生方式為每克微球加入3-5ml的2m〇L/L的HC1，靜態(tài)浸泡2-4 小時后過濾，除去鹽酸，然后用去離子水洗滌至pH值4.0-5.0。
[0033] 實施例1 取桿菌肽發(fā)酵液500ml，發(fā)酵單位765U/ml，向