一種pac1-r和glp-1r的雙向激動劑ot23及應用
【專利說明】—種PAC1-R和GLP-1R的雙向激動劑0T23及應用
[0001]
技術領域
[0002]本發(fā)明涉及生物化學領域，具體地說，涉及一種PACl-R和GLP-1R的雙向激動劑0T23及應用。
【背景技術】
[0003]胃泌酸調(diào)節(jié)肽(oxyntomodulin，OXM)是由胰高血糖素原基因在腸道L細胞和中樞神經(jīng)元內(nèi)轉錄加工后得到的37個氨基酸組成的腦腸肽。OXM通過同時激活胰高血糖素樣肽-Kglucagon-like peptide-1 ,GLP-1)受體和膜高血糖素受體(glucagon receptor，GCGR)發(fā)揮顯著抑制食欲，減少能量攝入，增加能量消耗，促進胰島素釋放及遠期細胞保護的功能。其中GLP-1R介導的有效降低血糖和保護胰島辟田胞的功能，是目前糖尿病藥物開發(fā)的重要靶點[1]。
[0004]垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(pituitaryadenylate cyclase activatingpolypeptide，PACAP)是由垂體分泌的、或目的組織自分泌和旁分泌的、具有重要生物學功能的神經(jīng)多肽，屬于是促胰液素/高血糖素/血管活性腸肽(vasoactive intestinalpeptide)家族中的新成員。PACAP的具有3個B類G蛋白偶聯(lián)受體:PACl-R是PACAP的特異受體;VPACl-R和VPAC2-R是PACAP和VIP的共同受體;PACAP對3個受體具有相同的激動功能。PACAP特異受體PACl-R主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)分泌組織和器官，包括睪丸、卵巢、呼吸道、肺、胰腺、胸腺等;介導PACAP顯著的抗細胞凋亡，調(diào)節(jié)細胞增殖分化;神經(jīng)保護和促進神經(jīng)修復;調(diào)節(jié)血管功能;促進激素分泌，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌平衡；調(diào)節(jié)性腺功能和生殖細胞的產(chǎn)生;參與消化活動調(diào)節(jié)能量代謝平衡;調(diào)節(jié)內(nèi)分泌平衡;促進覺醒，幫助提升學習和記憶能力；等的作用。而已有研究顯示PACl的激活有效抑制胸腺的衰退[2]，具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能的作用。
[0005]我們將OXM與PACAP進行比對后發(fā)現(xiàn):它們的N端13個氨基酸高度同源，如圖1所示，提示13個氨基酸可能承載OXM與PACAP共同的作用。并且作為內(nèi)源性的多肽類激素，OXM和PACAP均容易受到體內(nèi)二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase _4，DPP_4)的對多肽N端的水解，造成活性減退和喪失，甚至形成自身的抑制劑；因此體內(nèi)額外補充OXM和PACAP的N端高同源性的13氨基酸組成的短肽，可能有效稀釋DPP-4對OXM和PACAP的降解作用，從而增強OXM和PACAP的相關活性。
[0006]由11個氨基酸組成TAT序列(YGRKKRRQRRR)是最初發(fā)現(xiàn)于HIV病毒Tat蛋白中的具有穿膜功能的短肽，含有8個堿性氨基酸，生理條件下帶較高的正電荷，并形成穩(wěn)定的a螺旋結構。TAT具有強大的運載潛能，能將與之共價結合的外源性蛋白質(zhì)、DNA、RNA、化學藥物等轉運至細胞內(nèi)，甚至可以穿越血腦屏障。此過程不受所結合的化合物或復合物分子類型和大小的限制，并且對宿主細胞沒有顯著毒副作用。并且我們已發(fā)表的文章提示TAT可能有效促進VIP對PACl-R的結合和激活。
[0007]我們首次嘗試了將OXM的N端與PACAP高度同源13個氨基酸組成的短肽與TAT的C端10個氨基酸融合，構建出新的23個氨基酸組成的人工多肽，命名為0T23(序列:HSQGTFTSDYSKYGRKKRRQRRR);并就其體內(nèi)的生物學活性開展了探索性的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于構建既有效激活GLP-1R又能有效激活PACl-R的雙向激動劑，并能夠高效穿越生物屏障的人造多肽;本發(fā)明首次將OXM與PACAP高度同源的N端13個氨基酸與有穿膜功能的TAT的C端10個氨基酸融合，人工構建一個由23個氨基酸組成的PACl-R和GLP-1R的雙向激動劑0Τ23，其氨基酸序列如下所示:
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Gly Arg Lys Lys ArgArg Gln Arg Arg Arg。序列表如SEQ N0.1所示。
[0009]本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)0T23具有:
(1)有效激活PACl-R和GLP-1R，是一個雙向激動劑；
(2)顯著協(xié)助機體提高糖耐受，并抵抗胰島細胞凋亡，具有治療糖尿病的潛能；
(3)體內(nèi)體外顯著抵抗胸腺細胞的凋亡，抑制胸腺衰退，具有增強胸腺相關免疫功能的作用；
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
1.本發(fā)明的多肽是PACl-R和GLP-1R的雙向激動劑，具有一石二鳥的作用;例如對于糖尿病合并胸腺衰退相關免疫低下或免疫失調(diào)有雙重治療效果；可用于胸腺發(fā)育不全綜合征，免疫缺陷病，全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎等自身免疫性疾病，重癥感染、慢性感染、慢性腎炎等等伴有細胞免疫功能低下伴隨代謝障礙，如消瘦、厭食或糖尿病的癥狀治療。
[0010]2.本發(fā)明具有穿越生物屏障運輸?shù)墓δ苡行岣咂涞竭_靶點部位效率。
【附圖說明】
[0011]圖1為0Τ23序列的設計思路；
圖2為化學合成0Τ23的質(zhì)譜圖和高效液相純度分析圖；
圖3為0Τ23的受體選擇性鑒定；
圖4為0Τ23促進糖耐受；
圖5為0Τ23抑制胸腺細胞凋亡;細胞活性的MTT檢測；
圖6為0Τ23抑制胸腺衰退;A) sjTREC擴增曲線；B)胸腺和脾臟sjTREC的水平檢測；圖7為0T23同時治療糖尿病合并胸腺衰退的免疫低下;A)糖耐受測定；B)體重;C)胸腺指數(shù);D)胸腺sjTREC的水平檢測。
【具體實施方式】
[0012]下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步地描述，但具體實施例并不對本發(fā)明做任何限定。
[0013]實施例1:0T23的化學合成與鑒定
0T23的序列為:HSQGTFTSDYSKYGRKKRRQRR;采用化學合成的方法制備，0T23序列的設計思路如圖1所示。如圖2A所示，質(zhì)譜結果顯示化學合成多肽分子量為2988.25，與理論值相符;HPLC結果顯示純度大于99%(圖2B)。
[0014]實施例2: 0T23是PACl-R和GLP-1R雙向激動劑
受體競爭性結合實驗結果表明:如圖3A所示，0T23競爭125I標記的GLP-1對GLP-1R的半有效濃度EC5q為31.7±2.1nM，而對GCGP的EC5()大于10uM，因此0T23是GLP-lR的特異激動劑。
[0015]如圖3B所示，0T23有效競爭125I標記的PACAP對PACl-R的結合，其EC50為13.1 土
0.9nM，而0T23不能有效競爭125I標記的PACAP對VPACl-R和
VPAC2-R的結合(EC5q大于1uM)；因此0T23是PACl-1R的特異激動劑。
[0016]細胞增殖實驗結果顯示，0T23有效促進PACl-CHO細胞的增殖，但不能促進VPACl-CHO和VPAC2-R的增殖;進一步證明0T23是PACl-1R的特異激動劑。
[0017]綜上所述，0T23是PAQ-R和GLP-1R的雙向激動劑。
[0018]實施例3:0T23有效提高糖耐受
當GLP-l(10nmol/kg)和0T23(10nmol/kg)分別與高濃度葡萄糖(5mg/kg)共同腹腔注射小鼠，收集注射前(Oh)和注射后0.5-2h內(nèi)每隔0.5h的血糖，血糖指數(shù)(如圖4)顯示，0T23顯著降低了血糖指數(shù)的升高，提高機體處理高糖的能力。
[0019]實施例4:0T23促進胸腺淋巴細胞增殖，抑制胸腺淋巴細胞凋亡
體外制備地塞米松(Dex)誘導淋巴細胞凋亡模型，CCK8檢測細胞增殖率，流式細胞術Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡，進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)表明DeX(0.04yg/mL)顯著抑制小鼠胸腺淋巴細胞的增殖，誘導細胞凋亡，而0T23有效促進胸腺淋巴細胞的增殖，增加細胞存活率，且呈劑量相關效應(圖5);Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡結果表明，與061組相比(凋亡率86.3±5.8)，(^23(10醒01/1111)顯著降低細胞凋亡率(45.7±6.2)，明顯抑制淋巴細胞凋亡，可有效保護胸腺淋巴細胞。
[0020]實施例5:0T23有效恢復胸腺功能，逆轉胸腺萎縮
建立D半乳糖誘導免疫衰老(胸腺萎縮)小鼠模型后，腹腔注射lOnmol/kg 0T23，對照組小鼠注射相同劑量的生理鹽水，連續(xù)注射10天。處死小鼠，無菌條件下取胸腺和脾臟稱重后用研磨，收集細胞懸液，利用實時定量PCR定量分析小鼠胸腺T淋巴細胞及脾臟(外周)T細胞的sjTRECs水平(如圖6A)，從而評價小鼠胸腺生成和輸出功能。結果表明，注射0T23后，與對照組相比，胸腺和外周的sjTRECs含量均顯著上升(圖6)，證實0T23可有效回復胸腺功能，逆轉胸腺萎縮。
[0021 ]實施例6:0T23有效治療糖尿病合并免疫低下
建立D半乳糖聯(lián)合鏈脲佐菌素誘導免疫衰老(胸腺萎縮)合并糖尿病小鼠模型后，腹腔注射lOnmol/kg 0T23，對照組小鼠注射相同劑量的生理鹽水，連續(xù)注射20天。糖耐受測定顯示，0T23治療小鼠糖耐受顯著比對照組高(圖7A)，而且0T23有效逆轉體重下降，增加小鼠體重接近正常值(圖7B)。處死小鼠，無菌條件下取胸腺，測定胸腺指數(shù)，發(fā)現(xiàn)0T23有效提高胸腺指數(shù)(圖7C)，抑制胸腺萎縮;胸腺研磨后，收集細胞懸液，利用實時定量PCR定量分析小鼠胸腺T淋巴細胞及脾臟(外周)T細胞的sjTRECs水平，評價小鼠胸腺生成和輸出功能，結果顯示注射0T23后，與對照組相比，胸腺和外周的sjTRECs含量均顯著上升(圖7D)。證實0T23可同時治療糖尿病并有效回復胸腺功能，提高免疫力。
【主權項】
1.一種PACl-R和GLP-1R的雙向激動劑0T23，其氨基酸序列如下所示: His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Gly Arg Lys Lys ArgArg Gln Arg Arg Arg02.權利要求1所述的PACl-R和GLP-1R的雙向激動劑0T23在制備與PACl-R和GLP-1R受體相關疾病治療方面中的應用。3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述疾病為糖尿病、代謝失調(diào)合并免疫功能低下、或胸腺衰退。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種PAC1-R和GLP-1R的雙向激動劑OT23及應用。本發(fā)明首次將OXM與PACAP高度同源的N端13個氨基酸與有穿膜功能的TAT的C端10個氨基酸融合，人工構建一個由23個氨基酸組成的雙向激動劑OT23，其氨基酸序列如下所示：His？Ser？Gln？Gly？Thr？Phe？Thr？Ser？Asp？Tyr？Ser？Lys？Tyr？Gly？Arg？Lys？Lys？Arg？Arg？Gln？Arg？Arg？Arg。本發(fā)明的雙向激動劑對于糖尿病合并胸腺衰退相關免疫低下或免疫失調(diào)有雙重治療效果；可用于糖尿病及（或）代謝失調(diào)（如嚴重消瘦）合并免疫功能低下及（或）胸腺衰退的癥狀治療。
【IPC分類】A61P3/10, A61K38/16, A61P37/04, C07K14/00
【公開號】CN105504026
【申請?zhí)枴緾N201510996270
【發(fā)明人】張華華, 余榕捷
【申請人】廣東醫(yī)學院
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月24日