一種檢測(cè)豬巨細(xì)胞病毒抗體的方法及其專用試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)豬巨細(xì)胞病毒抗體的方法及其專用 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬巨細(xì)胞病毒(porcine cytomegalovirus，PCMV)屬于皰疼病毒目，皰疼病毒科，β 皰疹病毒亞科，巨細(xì)胞病毒屬，可引起新生豬鼻炎，表現(xiàn)為發(fā)育不良、鼻炎、肺炎、體重減少 等癥狀，普遍發(fā)生致命疾病。母豬妊娠第一次接觸該病毒會(huì)出現(xiàn)木乃伊胎、死產(chǎn)、弱仔等。豬 巨細(xì)胞病毒幾乎感染全世界豬群，但多為亞臨床癥狀，治愈后終身傳毒，傳播可通過(guò)鼻、目艮 分泌物、尿和娩出液體垂直傳播和交配傳播，死亡率達(dá)20~30% ;環(huán)境差、溫度波動(dòng)大、連續(xù) 生產(chǎn)和不空舍消毒可發(fā)病，也與細(xì)菌等混合感染;隨著異體器官移植進(jìn)行有感染人的威脅； 可與細(xì)菌性疾病、豬藍(lán)耳病毒、圓環(huán)病毒、偽狂犬等病毒混合感染，加重病情。因而，對(duì)豬巨 細(xì)胞病毒的檢測(cè)、預(yù)防與治療至關(guān)重要。
[0003] 豬巨細(xì)胞病毒的基因組全長(zhǎng)和結(jié)構(gòu)研究仍未十分清晰，基因組大小約為230~ 240kb，250個(gè)ORF，編碼基因165個(gè)，編碼二百多種蛋白質(zhì)。在編碼的蛋白質(zhì)中，糖蛋白含量豐 富，如gB蛋白、gCgB蛋白、gDgB蛋白、gEgB蛋白、gGgB蛋白、gHgB蛋白、glgB蛋白、gJgB蛋白、 gKgB蛋白、gLgB蛋白、gMgB蛋白等等。其中g(shù)B蛋白由于含量最多，是主要的抗原，是目如研究 最多、常用于建立檢測(cè)方法的糖蛋白。
[0004] 目前檢測(cè)豬巨細(xì)胞病毒的方法主要是根據(jù)臨床癥狀、血清學(xué)檢驗(yàn)、熒光抗體檢測(cè)、 PCR檢測(cè)、ELISA以及檢測(cè)巨細(xì)胞中形成鷹眼狀包涵體等光鏡方法，但血清學(xué)和熒光抗體檢 測(cè)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、需要大量?jī)x器設(shè)備、檢測(cè)靈敏度亦受限，且不能高通量檢驗(yàn);PCR檢測(cè)不能檢 測(cè)血清中針對(duì)病原體的抗體，尤其是病原體出現(xiàn)較大變異后;ELISA利用了抗原抗體相互作 用，以及標(biāo)記物進(jìn)行放大信號(hào)，靈敏度大大提高，是目前檢測(cè)豬巨細(xì)胞病毒常用的方法。
[0005] 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法(chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA)作為上 世紀(jì)70年代發(fā)展的技術(shù)，結(jié)合了化學(xué)發(fā)光的高靈敏性和免疫的高特異性的優(yōu)勢(shì)，利用標(biāo)記 酶促進(jìn)發(fā)光底物發(fā)光，放大信號(hào)，具有靈敏度高、分析方法簡(jiǎn)單快捷、檢測(cè)時(shí)間短、診斷范圍 寬、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，繼承了ELISA的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)靈敏度是ELISA的10倍以上，可重復(fù)性高于 ELISA，不需要特殊、大型、昂貴設(shè)備。目前，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腫瘤標(biāo)記物檢測(cè)、糖尿病、心臟 病、高血壓、艾滋病以及食品安全檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫法不僅目前在檢測(cè)和預(yù)防診治中起 到重要的作用，將來(lái)會(huì)有更大的應(yīng)用空間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是如何檢測(cè)豬巨細(xì)胞病毒。
[0007] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明首先提供的一種抗原蛋白。
[0008] 所述抗原蛋白，自N末端至C末端依次可包括N端元件和C端元件;所述N端元件的氨 基酸序列可如序列表中序列2自N末端起第1至141位所示;所述C端元件的氨基酸序列可如 序列表中序列2自N末端起第147至244位所示。
[0009] 所述抗原蛋白中，在所述N端元件和所述C端元件之間還具有連接肽。
[0010] 所述連接肽的氨基酸序列可如序列表中序列2自N末端起第142至146位所示。
[0011] 所述抗原蛋白具體可為al)或a2)或a3)或a4):
[0012] al)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；
[0013] a2)在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；
[0014] a3)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白質(zhì)；
[0015] a4)將al)或a2)或a3)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加得到的與抗原蛋白相關(guān)的蛋白質(zhì)。
[0016] 其中，序列表中序列2由244個(gè)氨基酸殘基組成;序列表中序列4由409個(gè)氨基酸殘 基組成。
[0017] 為了使a 1)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或 羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0018] 表1、標(biāo)簽的序列
[0020] 上述a4)中的蛋白質(zhì)，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為 不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0021] 上述a4)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。
[0022] 上述a4)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列1或序列表中序列3所示的 DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突 變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
[0023] 編碼所述抗原蛋白的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024] 所述編碼所述抗原蛋白的核酸分子，自5'末端至3'末端依次包括區(qū)段甲（編碼所 述N端元件)和區(qū)段乙（編碼所述C端元件）；所述區(qū)段甲的核苷酸序列如序列表中序列1自5' 末端起第1至423位所示；所述區(qū)段乙的核苷酸序列如序列表中序列1自5'末端起第439至 735位或序列表中序列1自5 '末端起第439至732位所示。
[0025] 所述編碼所述抗原蛋白的核酸分子，具體可為如下el)或e2)或e3)或e4)或e5)或 e6)所不的DNA分子：
[0026] el)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
[0027] e2)核苷酸序列是序列表中序列1自5'末端起第1至732位所示的DNA分子；
[0028] e3)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
[0029] e4)核苷酸序列是序列表中序列3自5'末端起第1至1227位所示的DNA分子；
[0030] e5)與el)或e2)或e3)或e4)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編 碼所述抗原蛋白的DNA分子；
[0031] e6)在嚴(yán)格條件下與el)或e2)或e3)或e4)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述抗 原蛋白的DNA分子。
[0032] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也可 以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0033]其中，序列表中序列1由735個(gè)核苷酸組成，序列表中序列1的核苷酸編碼序列表中 序列2所示的氨基酸序列;序列表中序列3由1230個(gè)核苷酸組成，序列表中序列3的核苷酸編 碼序列表中序列4所示的氨基酸序列。
[0034] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方 法，對(duì)本發(fā)明的編碼所述抗原蛋白的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過(guò)人工修飾的，具有與本 發(fā)明分離得到的所述抗原蛋白的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要編碼所述 抗原蛋白，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0035] 這里使用的術(shù)語(yǔ)"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本發(fā) 明的編碼序列表的序列2或序列表的序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列 具有75%或更高，或80%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核 苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之 間的同一性可以用百分比（％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。
[0036] 所述抗原蛋白在制備試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述試劑盒的功 能可為Π )或f2)或f3):
[0037] Π )檢測(cè)豬巨細(xì)胞病毒抗體；
[0038] f2)檢測(cè)待測(cè)豬是否感染了豬巨細(xì)胞病毒；
[0039] f3)檢測(cè)待測(cè)哺乳動(dòng)物是否感染了豬巨細(xì)胞病毒。
[0040] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)待測(cè)血清中的豬巨細(xì)胞病毒抗體的方法。
[0041] 本發(fā)明所提供的檢測(cè)待測(cè)血清中的豬巨細(xì)胞病毒抗體的方法，可包括如下步驟： 通過(guò)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法檢測(cè)待測(cè)血清中的豬巨細(xì)胞病毒抗體;所述化學(xué)發(fā)光酶免疫分 析法中，以所述抗原蛋白為包被原。
[0042]所述化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法中，可以HRP標(biāo)記山羊抗豬IgG抗體作為二抗。
[0043] 上述方法中，所述抗原蛋白的包被濃度可為0.170μg/ml~0.230μg/ml