利用特征六肽制備柞蠶絲素蛋白抗體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及多克隆抗體的制備方法，尤其涉及一種利用特征多肽制備柞蠶絲素蛋 白抗體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蠶絲是一種天然高分子蛋白質(zhì)纖維，主要分為家蠶絲和野蠶絲兩大類。野蠶也叫 柞蠶，因喜食柞樹(shù)葉得名，繭可繅絲，主要用于織造柞絲綢。我國(guó)是最早利用柞蠶和放養(yǎng)柞 蠶的國(guó)家，但其起源一直是研究的熱點(diǎn)難點(diǎn)，迫切需要一種更科學(xué)的方法來(lái)鑒定早期墓葬 或遺跡中的絲織品。以往鑒定古代絲織品的方法也比較多，但蠶絲作為一種有機(jī)高分子材 料長(zhǎng)期處于墓葬或遺址環(huán)境中，必然會(huì)受到多種因素影響，從而出現(xiàn)蠶絲蛋白質(zhì)發(fā)生降解 及大分子鏈的斷裂等問(wèn)題，采用傳統(tǒng)的一些方法很難檢測(cè)到絲素蛋白的存在。因此如何采 用自然科學(xué)的先進(jìn)手段，建立絲織品微痕檢測(cè)技術(shù)體系，從印痕，殘留物，土壤中提取古代 絲綢的信息，對(duì)絲綢起源的研究非常迫切。目前蛋白質(zhì)檢測(cè)的先進(jìn)技術(shù)是基于抗體-抗原的 Western Blotting或ELISA法，柞蠶絲素蛋白抗體的制備是該研究的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，目的在于提供一種利用特征多肽制備柞 蠶絲素蛋白抗體的方法，它操作簡(jiǎn)單快捷，且制備的抗體具有很強(qiáng)的特異性。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)解決方案是：一種利用特征六肽制備柞蠶絲 素蛋白抗體的方法，其特征是，包括以下步驟：
[0005] 步驟一:利用Fmoc法合成序列為"CGSGAGG"的多肽，并通過(guò)所訴多肽的N端的半胱 氨酸使該多肽與匙孔血藍(lán)蛋白偶聯(lián)得到完全抗原；
[0006] 步驟二：用生理鹽水稀釋所述完全抗原，將稀釋后的完全抗原與Quick Antibody-Rabbit 5W佐劑 (Quick Antibody 系列免疫佐劑 ，市面上可購(gòu)) 均勾混合 ，得到初次免疫所用 的試劑；
[0007] 選取2只大白兔進(jìn)行初次免疫和加強(qiáng)免疫，免疫前抽取兔耳血樣做對(duì)照；
[0008] 首先對(duì)兔子進(jìn)行初次免疫，然后對(duì)兔子進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫使用的試劑與初 次免疫一致；當(dāng)兔子血樣中的抗體的效價(jià)達(dá)到1:10000時(shí)，收集免疫后的兔子血液，并使血 塊充分收縮及抗血清完全析出，然后收集抗血清并離心處理得到上清液，分裝備用；
[0009] 步驟三：利用免疫親和層析技術(shù)對(duì)抗血清進(jìn)行純化。先將合成的半抗原（即多肽 "GSGAGG"）和層析填料交聯(lián)劑Sulf0-1 ink-gel (美國(guó)Pierce公司生產(chǎn)，市面上可購(gòu))進(jìn)行交 聯(lián)，使GSGAGG N端的甘氣酸封閉；
[0010] 用2〇-251111、5〇1111、？!17.4的？83對(duì)柱進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理的流速為6〇-651111/11。
[0011] 用50mM、pH7.4的PBS將15ml的抗血清稀釋至20ml，稀釋后上樣。重復(fù)上樣一次。 [0012]用 30-351111、5011^、？!17.4的？83對(duì)柱進(jìn)行清洗，清洗的流速為60-651111/11。用？!13.0、 0.1 M的glycine-HCL(甘氨酸鹽酸)對(duì)抗體進(jìn)行洗脫。洗脫完成后用含50mM、pH7.4、含0.02% 硫柳汞鈉的PBS洗滌多肽柱，得到純化后的抗體調(diào)節(jié)pH至7.4并于3-5°C儲(chǔ)存；
[0013]步驟四：抗體特異性效果測(cè)定:抗原絲素蛋白以lμg/ml的濃度包被，4°C包被過(guò)夜。 將抗體分別稀釋240000倍、60000倍、20000倍、10000倍、5000倍、1000倍、200倍，50μ1/孔的 量上樣，37-39°C下溫育lh。用TBST(由NaCl 8克、KCl 0.2g、Trise base 3克，加純水800ML， 用濃鹽酸調(diào)PH到7.4，然后加水到1000ML，得到TBS溶液;TBS里加0.1 %吐溫20，即0.1 %的洗 滌液）以200μ1/孔洗滌1-3遍。酶標(biāo)二抗以1:5000稀釋使用，50μ1/孔、37-39°C下溫育lh。用 TBST以200μ1/孔洗滌2-4遍。以100μΙ/孔加入TMB于陰暗處顯色，顯色I(xiàn)Omin后，以100μΙ/孔 加入2Μ的H 2S〇4終止；
[0014]步驟五:用酶標(biāo)儀測(cè)定OD45Q值；
[0015]當(dāng)OD45Q值>0.6,則證明所檢測(cè)的樣品呈現(xiàn)陽(yáng)性，說(shuō)明樣品中含有絲素蛋白；
[0016]當(dāng)OD45Q值<0.6,則證明所測(cè)得的樣品呈現(xiàn)陰性，說(shuō)明樣品中不含有絲素蛋白。 [0017]在所述步驟二中，用生理鹽水將完全抗原稀釋到2倍最終濃度。
[0018] 在所述步驟二中，在配制初次和加強(qiáng)免疫試劑時(shí)，稀釋后的完全抗原與佐劑是按 體積比1:1進(jìn)行混合。
[0019] 在所述步驟二中，對(duì)兔子進(jìn)行初次免疫的方法是:通過(guò)后腿小腿肌肉注射免疫兔 子，每只兔子注射I OOyl;對(duì)兔子進(jìn)行加強(qiáng)免疫的方法是:在初次免疫的第21天按同樣方式 加強(qiáng)免疫一針。
[0020] 在所述步驟二中，收集抗血清后處理的方法是：在溫度為4°C于3000g條件下離心 15min，分裝上清液，放置于-80°c儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br>[0021 ]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果是：
[0022] (1)本發(fā)明方法通過(guò)柞蠶絲素蛋白的特征多肽制備的多克隆抗體具有很強(qiáng)的特異 性，經(jīng)酶聯(lián)免疫法分析可知，該抗體能夠與柞蠶絲素蛋白具有明顯的免疫反應(yīng)，靈敏度很 高，可用于檢測(cè)柞蠶絲素蛋白，特別適合用于不完整絲素蛋白的檢測(cè)分析。
[0023] (2)與傳統(tǒng)方法利用天然蛋白質(zhì)的大分子制備的抗體不同，本發(fā)明制備的抗體不 僅能夠檢測(cè)完整的絲素蛋白，也能用于檢測(cè)諸如古代絲織品中已經(jīng)斷裂的絲素蛋白分子， 從而為中國(guó)早期墓葬和遺跡中的絲織殘留品提供一種敏感特異快捷的識(shí)別方法，為絲綢考 古和起源分析提供新的科學(xué)依據(jù)。
[0024] (3)本發(fā)明采用的免疫佐劑，無(wú)毒無(wú)害，不含蛋白質(zhì)成分，不破壞抗原天然構(gòu)型，而 且免疫方式簡(jiǎn)單，無(wú)需乳化抗原（只需要簡(jiǎn)單混合即可免疫），同時(shí)免疫周期短，抗原用量 少。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例僅對(duì)本申請(qǐng)進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不 應(yīng)理解為對(duì)本申請(qǐng)的限制。
[0026] 在NCBI(http://www.ncbi .nlm.nih.gov/pubmed/)上查得柞香絲素蛋白的氨基酸 序列。
[0027]通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，確定"GSGAGG"多肽片段出現(xiàn)頻率較高，是柞蠶絲素的特征多肽，故 以此片段制備抗原。
[0028]以下具體說(shuō)明本發(fā)明的制備方法。
[0029] 實(shí)施例1:
[0030] -種利用特征六肽制備柞蠶絲素蛋白抗體的方法，它包括以下步驟：
[0031]完全抗原合成：
[0032]利用Fmoc法合成半抗原（8卩"CGSGAGG"多肽序列），在"CGSGAGG"多肽序列的N端添 加半胱氨酸使該多肽與匙孔血藍(lán)蛋白（KLH)偶聯(lián)。通過(guò)交聯(lián)劑的作用，"CGSGAGG"N端的半胱 氨酸上的巰基和KLH伯胺形成共價(jià)鍵，從而將多肽和KLH偶聯(lián)起來(lái)，得到完全抗原。
[0033]用生理鹽水將完全抗原稀釋到2倍最終濃度，將稀釋后的完全抗原與Quick Antibody-Rabbit 5W佐劑按體積比1:1均勻混合，得到初次免疫所用的試劑。加強(qiáng)免疫使用 的試劑與初次免疫一致。
[0034] 抗體制備：
[0035] 選取2只大白兔（15周齡左右)進(jìn)行初次免疫和加強(qiáng)免疫。免疫前先抽取兔耳血樣 做對(duì)照。初次免疫是通過(guò)后腿小腿肌肉注射免疫兔子，每只兔子注射100μΙ。然后在初次免 疫的第21天用同樣的試劑按同樣方式加強(qiáng)免疫一針。在第二次免疫后的第10天靜脈取血檢 測(cè)抗血清效價(jià)。
[0036] 當(dāng)兔子血樣中的抗血清的效價(jià)達(dá)到1:10000時(shí)，殺死兔子收集血液，收集的大量血 液置室溫下讓其凝固；將凝固血液置于37°C溫箱內(nèi)放置30min，再置于4°C冰箱過(guò)夜，使血塊 充分收縮及抗血清完全析出。收集抗血清，4°C下3000g離心10min，分裝上清液，放-80°C儲(chǔ) 存?zhèn)溆谩?br>[0037] 抗體純化：
[0038] 利用免疫親和層析技術(shù)對(duì)抗血清進(jìn)行純化。先將合成的半抗原（即多肽"GSGAGG"） 和層析填料51^〇-1丨111^61進(jìn)行交聯(lián)，使"6364661端的甘氨酸封閉。用2〇1111、5〇11^、？!17.4 的I 3BS對(duì)柱進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理的流速為60ml/h。用50mM、pH7.4的PBS將15ml的抗血清稀釋 至20ml，稀釋后上樣。重復(fù)上樣一次。用30ml、50mM、pH7.4的I 3BS對(duì)柱進(jìn)行清洗，清洗的流速 為60ml/h。用pH3.0、0.1M的glycine-HCL對(duì)抗體進(jìn)行洗脫。洗脫完成后用含50mM、pH7.4、含 0.02 %硫柳汞鈉的PBS洗滌多肽柱，得到純化后的抗體調(diào)節(jié)pH至7.4并于3°C儲(chǔ)存。
[0039] 抗體特異性效果測(cè)定:抗原絲素蛋白以lμg/ml的濃度包被，4°C包被過(guò)夜。將抗體 分別稀釋240000倍、60000倍、20000倍、10000倍、5000倍、1000倍、200倍，50μ1/孔的量上樣， 37°C下溫育lh。用TBST以200μ1/