一種四分支多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生命科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種四分支多肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤發(fā)病率從有癌癥記錄以來，一直呈上升的趨勢，特別是過去二三十年以來，月中 瘤發(fā)病以每年在3 %到5 %的速度在提高，而且在提高當(dāng)中80 %新發(fā)腫瘤發(fā)生在發(fā)展中國 家。目前全世界每年新發(fā)腫瘤約1300萬，當(dāng)年死亡病例達(dá)到800萬，而我國每年新增患者約 250萬，死亡近180萬。最近的流行病學(xué)調(diào)查顯示，癌癥已成為我國主要大中型城市的第一死 亡原因。手術(shù)、放療以及化療仍是目前腫瘤治療的主要手段，但手術(shù)對中晚期患者療效差， 而放化療由于其副作用大，對目標(biāo)的選擇性不高等都顯示出傳統(tǒng)治療方式的局限性。
[0003] 常用的疫苗包括減毒活疫苗、滅活疫苗和亞單位疫苗。目前的亞單位疫苗多是采 用重組DNA技術(shù)用微生物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生。但分子量較小的抗原很難用重組DNA技術(shù)制 備，化學(xué)合成便成為較為簡便的途徑。合成肽疫苗是根據(jù)抗原的氨基酸序列設(shè)計(jì)的用化學(xué) 方法合成的一種安全性很高的疫苗，但其分子量小、免疫原性弱并且僅針對單一的抗原表 位，這使其應(yīng)用受到限制。將合成肽疫苗與其它載體蛋白偶聯(lián)雖然能提高前者免疫原性，但 因?yàn)橐肓藷o關(guān)蛋白，無法估計(jì)其對目標(biāo)抗原肽結(jié)構(gòu)的影響，所以效果仍不理想。分支狀多 抗原肽系統(tǒng)通常是指利用賴氨酸(Lys)的兩個(gè)氨基分別能與另一個(gè)氨基酸的羧基形成肽鍵 這一特征，以數(shù)個(gè)Lys(n)作為核心。將多條相同或不相同的抗原肽連接，通過化學(xué)合成方法 制備的大分子分支狀多肽。多抗原肽(Multiple antigen peptides,MAP)最先由James PT 在1988年提出，這一系統(tǒng)能在不引入其它蛋白質(zhì)的情況下，解決合成的抗原肽疫苗免疫原 性弱的困難。James在研究中還發(fā)現(xiàn)，MAP能明顯增加線性抗原肽的免疫原性，其誘導(dǎo)家兔產(chǎn) 生的抗體水平明顯高于單拷貝短肽和偶聯(lián)至琥珀?；€孔血藍(lán)蛋白（Keyhole limpethemocyanin，KLH)載體的肽。此后，很多人嘗試采用MAP的技術(shù)研制針對多種疾病的 疫苗。天然抗原不僅含有B、T細(xì)胞表位和M H C限制性表位等有利于免疫識別和應(yīng)答的表 位，同時(shí)還含有不利于免疫反應(yīng)、甚至導(dǎo)致免疫耐受的優(yōu)勢非中和表位或抑制性表位等。人 工合成的疫苗可根據(jù)需要選擇有利于免疫應(yīng)答的表位，避開不利于免疫應(yīng)答的表位，在保 持抗原特異性的基礎(chǔ)上誘導(dǎo)特定的免疫應(yīng)答。將選擇的表位制備成分支狀多抗原肽，一方 面能增加其免疫原性，另一方面還能將不同的表位組合在同一個(gè)MAP上以更好發(fā)揮疫苗的 功能。
[0004] 疫苗保護(hù)效果的優(yōu)劣很大程度上取決于其中能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)的抗原表位。構(gòu) 建MAP疫苗時(shí)常選擇的表位有以下幾種:MAP最常選擇的抗原表位是特異性激活機(jī)體體液免 疫的Th細(xì)胞表位或B細(xì)胞表位。近年研究發(fā)現(xiàn)，Th細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位在蛋白分子上的同 時(shí)存在能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。因?yàn)長ys分支狀骨架連接的多個(gè)抗原肽可以相同， 也可以不同，所以MAP疫苗可以滿足這一要求。這一優(yōu)勢在瘧疾疫苗的研究中得到運(yùn)用。將 瘧原蟲生活史不同時(shí)期的三種特異性蛋白的抗原表位組合到一個(gè)MAP疫苗中，組成由兩個(gè)T 細(xì)胞表位和一個(gè)B細(xì)胞表位的MAP疫苗，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，從而有效激活體液免 疫反應(yīng)。刺激機(jī)體細(xì)胞免疫的MHC分子特異性識別的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)表位。CTL是抗病 毒免疫的主要成分之一，雖然不能預(yù)防病毒感染，但可以清除已感染的細(xì)胞，并通過細(xì)胞因 子限制病毒的復(fù)制。PRLla是鼠白血病腫瘤排斥抗原中被CTL識別的短肽，采用八拷貝pRLla 作為腫瘤候選疫苗免疫小鼠，致敏小鼠的脾細(xì)胞發(fā)生了CTL反應(yīng)，并明顯抑制腫瘤生長。位 于抗原分子空間構(gòu)象隱蔽處的表位，通常不易被APC識別并呈遞，因而無法刺激免疫系統(tǒng)。 通過單獨(dú)合成這些抗原表位，合成肽疫苗能打破這種結(jié)構(gòu)性限制。一項(xiàng)關(guān)于HIVMAP位，其中 兩個(gè)表位源于gpl20蛋白橋聯(lián)片(Bridgingsheetregion)結(jié)構(gòu)，另一個(gè)表位參與構(gòu)成CD4+分 子結(jié)合部位，這三個(gè)表位都位于天然gp 120蛋白分子的內(nèi)部，天然感染時(shí)均無法激活機(jī)體免 疫系統(tǒng)，但化學(xué)合成由這三個(gè)表位構(gòu)成的MAP在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了能與gp 120結(jié)合的高效價(jià)抗 體。
[0005] 免疫治療作為一種新的腫瘤治療方式，由于其特異性強(qiáng)，選擇性高，毒副作用小， 越來越受到學(xué)者和患者的歡迎。其中以TAA結(jié)合DC為基礎(chǔ)的腫瘤治療方式。但目前發(fā)現(xiàn)的腫 瘤相關(guān)抗原大多具有組織特異性，如AFP只針對肝癌等，以這些抗原來進(jìn)行免疫治療，只能 對相應(yīng)的腫瘤起作用，限制了以這些抗原為靶標(biāo)的腫瘤疫苗的廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題提出的一種廣泛適用于多種腫瘤治療和免 疫的四分支多肽。
[0007] 本發(fā)明提供了一種四分支多肽，結(jié)構(gòu)式為：
[0009] 上述的四分支多肽的四個(gè)分支中的氨基酸序列均可以置換成S0X2或0CT4其他段 的氨基酸肽鏈。本發(fā)明的一種人工合成的功能性四分支多肽產(chǎn)物，（AA 1-AA2)2-(Lys - 順2)2-Lys-SER-NH2,其中ΑΑι、ΑΑ2分別為S0X2和0CT4的15個(gè)AA的肽段。S0X2和0CT4是一種 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，即使是癌細(xì)胞中，表達(dá)水平也是在具有干細(xì)胞樣特征的癌干細(xì)胞中特 別高。S0X2和0CT4在肺癌、腎癌等多種癌中表達(dá)，在正常組織中的表達(dá)僅限于胚性干細(xì)胞和 神經(jīng)干細(xì)胞等中。所以應(yīng)用S0X2和0CT4作為抗原誘導(dǎo)形成的CTL可以對多種腫瘤起作用，從 而得到廣泛引用。本制備本發(fā)明的四分支多肽時(shí)，選取S0X2和0CT4表位中AAl、AA2段設(shè)計(jì)其 MAP結(jié)構(gòu)，采用有機(jī)化學(xué)Fmoc保護(hù)的氨基酸固相合成法在多肽自動(dòng)合成儀(ABI433A型)上自 多肽的羧基端(C)向氨基端(N)合成四分支多肽，反應(yīng)完成后得到的肽樹脂采用TEA法將多 肽從樹脂上裂解下來。。
[0010] 進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供一種能夠編碼如權(quán)利要求1或2所述四分支多肽的DNA序 列。
[0011]更進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供一種細(xì)胞毒性T細(xì)胞，由上述的四分支多肽誘導(dǎo)而得 到。
[0012]另一方面，本發(fā)明提供上述的四分支多肽、相應(yīng)的DNA以及相應(yīng)的CTL細(xì)胞相關(guān)的 應(yīng)用，具體為：
[0013] 上述的四分支多肽在制備提高機(jī)體免疫能力藥物或試劑盒中的應(yīng)用。
[0014] 上述的四分支多肽在制備抗腫瘤疫苗中的應(yīng)用。
[0015] 上述四分支多肽相對應(yīng)的DNA在制備提高機(jī)體免疫能力藥物或試劑盒中的應(yīng)用。
[0016] 上述四分支多肽相對應(yīng)的DNA在制備抗腫瘤疫苗中的應(yīng)用。
[0017] 上述相應(yīng)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞在制備提高機(jī)體免疫能力藥物或試劑盒中的應(yīng)用。
[0018] 上述相應(yīng)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞在制備抗腫瘤疫苗中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明的分支多肽合成產(chǎn)物具有綜合提高機(jī)體免疫原性和延長其半衰期的功效， 在制備抗腫瘤的藥物或疫苗中具有廣泛的應(yīng)用前景。同時(shí)，本發(fā)明的四分支多肽在應(yīng)用于 抗腫瘤疫苗制備時(shí)，與全基因序列腺病毒負(fù)載DC疫苗相比，由于多肽疫苗沒有腺病毒載體 的參與，不必考慮載體及其整合的安全性，也不必考慮全長蛋白中某些非優(yōu)