松茸液態(tài)菌種的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，涉及一種松茸液態(tài)菌種的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 松茸是一種珍貴稀有的野生食用菌，營養(yǎng)價(jià)值高，目前在人工培育中，松茸菌種仍 采用原始的培育方法，培育過程缺乏有效的控制和管理，營養(yǎng)成分分布不均勻，在松茸菌種 培養(yǎng)過程中需要經(jīng)過接種、靜置培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)等多個(gè)步驟，而且還需要向培養(yǎng)器皿中人 工通入無菌空氣，造成培養(yǎng)步驟繁瑣、勞動(dòng)強(qiáng)度高。
[0003] 為了解決以上存在的問題，人們一直在尋求一種理想的技術(shù)解決方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 由鑒于此，本發(fā)明確有必要提供一種培養(yǎng)步驟簡單、成本低廉的松茸液態(tài)菌種的 培養(yǎng)方法，以解決上述問題。
[0005] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種松茸液態(tài)菌種的培養(yǎng)方法，具體包括以下步驟： 提供一種松茸液態(tài)菌種培養(yǎng)基； 將松茸原種接種到所述松茸液態(tài)菌種培養(yǎng)基中進(jìn)行密封培養(yǎng)，當(dāng)所述松茸原種的菌絲 萌發(fā)后，每天搖動(dòng)所述松茸液態(tài)菌種培養(yǎng)基1次，直至獲得松茸液態(tài)菌種。
[0006] 基于上述，提供所述松茸液態(tài)菌種培養(yǎng)基的步驟包括： 將松樹枝200~300克、土豆200~400克和水1200~1800mL進(jìn)行混合，然后依次經(jīng)過煮 沸、冷卻、過濾處理后得到濾液； 分別將碳源1 〇~150克、氮源10~200克加入到1 OOOmL所述濾液中，混合制得松茸液態(tài) 菌種營養(yǎng)濾液； 分別將谷殼15~30克、KH2PO4 0.2~2克、MgS〇4 0.1~2克、檸檬酸0.1~3克加入到 150mL所述松茸液態(tài)菌種營養(yǎng)濾液中進(jìn)行混合，制得pH值為5~7的松茸液態(tài)菌種培養(yǎng)基。
[0007] 基于上述，所述碳源為乳糖、蔗糖、玉米粉、果糖中的一種或幾種的組合。
[0008] 基于上述，所述氮源為酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、尿素中的一種或幾種的組合。
[0009] 優(yōu)選地，所述碳源為蔗糖10~80克;所述氮源為豆粉10~90克。
[0010] 基于上述，所述松茸原種的菌絲萌發(fā)后，每24小時(shí)定時(shí)搖動(dòng)所述松茸液態(tài)菌種培 養(yǎng)基1次，使得所述松茸液態(tài)菌種培養(yǎng)基中的谷殼完全被浸濕。簡言之，在培養(yǎng)期間，每天定 時(shí)搖動(dòng)所述羊肚菌液態(tài)菌種培養(yǎng)基1次，比如每天早上9點(diǎn)、每天上午11點(diǎn)或每天下午4點(diǎn)搖 動(dòng)所述羊肚菌液態(tài)菌種培養(yǎng)基1次，使所述谷殼完全浸沒在所述松茸液態(tài)菌種培養(yǎng)基中等。
[0011] 基于上述，所述松茸原種的培養(yǎng)步驟包括： 將麩皮15~25克、谷殼20~30克、玉米粉8~12克，分別用水浸泡、過濾后，分別加水煮 沸、過濾瀝干，然后混合制得混合料；向所述混合料中加入葡萄糖5~10克、酵母粉1~2克、 碳酸鈣1~5克、磷肥1~5克;混合制得松茸原種培養(yǎng)基； 將所述松茸母種接種到所述松茸原種培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，獲得所述松茸原種。
[0012] 基于上述，所述松茸母種的培養(yǎng)步驟包括： 將土豆50~60克、瓊脂8~14克、蛋白胨0.5~0.8克和葡萄糖5~7克加入到1500mL~ 1800mL的水中進(jìn)行加熱，直至所述瓊脂全部煮化，得到松茸母種培養(yǎng)基； 將松茸菌株的菌絲接入到所述松茸母種培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，獲得所述松茸母種。
[0013] 為了更好的了解不同時(shí)期羊肚菌菌種的生長情況，確定液態(tài)培養(yǎng)時(shí)間，在培育時(shí) 間為0~240h范圍內(nèi)，利用專用的采樣器24h取樣1次，測(cè)定所述松茸菌種的菌絲體干重。具 體操作步驟為:在松茸菌種每階段培養(yǎng)結(jié)束后，選用采樣器抽取每階段培養(yǎng)瓶中適量的液 體，以轉(zhuǎn)速為4000r/min的速度離心15min，然后棄去清液，將得到的所述松茸菌絲體用蒸餾 水清洗數(shù)次后，置于真空干燥箱中，40°C下烘干至恒重，計(jì)算培養(yǎng)得到的所述松茸菌絲體干 重。實(shí)驗(yàn)中，每組進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)取3次試驗(yàn)結(jié)果的平均值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐 標(biāo)，以松茸菌絲體干重為縱坐標(biāo)，繪制松茸菌絲體的生長曲線，松茸菌絲體干重計(jì)算公式如 下： Y=M/V 式中;Y代表松茸菌絲體干重，單位g/L; Μ代表菌絲體干燥后的質(zhì)量，單位g; V代表抽取液體的體積，單位L。
[0014] 本發(fā)明相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步，具體的說，本發(fā)明所 提供的松茸液態(tài)菌種培養(yǎng)方法，在松茸液態(tài)菌種培養(yǎng)的過程中，不需要對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù) 搖動(dòng)，只需每天對(duì)所述松茸液態(tài)菌種培養(yǎng)基搖動(dòng)一次即可，降低了培養(yǎng)過程所用設(shè)備的利 用率，從而降低了生產(chǎn)成本，而且該培養(yǎng)方法簡單、易于操作;每天采用定時(shí)搖動(dòng)保證了所 述松茸液態(tài)菌種營養(yǎng)液的均勻性。
[0015] 進(jìn)一步講，松茸液態(tài)菌種菌絲的生長以谷殼為載體，利用谷殼之間的間隙吸收營 養(yǎng)，并附著在液態(tài)表面上的谷殼上進(jìn)行生長，無需額外向其培養(yǎng)基中通入無菌空氣，就可以 成功培養(yǎng)出松茸液態(tài)菌種，減少了繁雜的操作和許多昂貴的無菌設(shè)備，節(jié)約了成本并縮短 了菌種的培育時(shí)間。
[0016] 更進(jìn)一步講，本發(fā)明中所述松茸液態(tài)菌種培養(yǎng)基的原料經(jīng)過煮汁后再使用，使得 所述松茸液態(tài)菌種培養(yǎng)基的養(yǎng)料分布比較均勻，有利于松茸液態(tài)菌種菌絲吸收利用;并在 菌種培育的各階段采用不同的培養(yǎng)基原料，使得不同培養(yǎng)階段的松茸菌種菌絲能夠?qū)ε囵B(yǎng) 基中的營養(yǎng)成分充分吸收，達(dá)到最好的培育效果，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)松茸的人工栽培。
【附圖說明】
[0017] 圖1是實(shí)施例1中的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)松茸液態(tài)菌種的菌絲體干重影響曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面通過【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0019] 本實(shí)施例提供一種松茸液態(tài)菌種的培養(yǎng)方法，具體包括以下步驟： 實(shí)施例1 將松樹枝200克、土豆200克加水1500mL進(jìn)行混合、煮沸并保持30分種，然后過濾、冷卻 制得濾液； 向lOOOmL所述濾液中加入碳源、氮源，充分溶解后取150mL裝入培養(yǎng)瓶中，然后向所述 培養(yǎng)瓶加入15克洗凈烘干谷殼、0.3克KH2P〇4、0.3克MgS〇4和0.5克檸檬酸，混合均勻制得松 茸液態(tài)菌種培養(yǎng)基； 將裝有所述松茸液態(tài)菌種培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶經(jīng)滅菌鍋高溫滅菌、冷卻后，放置于密封的 無菌接種箱中，向所述培養(yǎng)瓶中接入所述松茸原種，置于24°C恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)所述松 茸原種的菌絲萌發(fā)后，每天早上9點(diǎn)定時(shí)充分搖動(dòng)所述松茸液態(tài)菌種培養(yǎng)基1次，培養(yǎng)一定 時(shí)間獲得所述松茸液態(tài)菌種。
[0020]本實(shí)施例中所提供的一種松茸液態(tài)菌種的培養(yǎng)方法，在具體培養(yǎng)過程中，外界條 件會(huì)對(duì)所述松茸液態(tài)菌種的生長產(chǎn)生較大影響；下面分別從所述松茸液態(tài)菌種培養(yǎng)基的初 始pH值、碳源、氮源方面對(duì)本實(shí)施例所提供的松茸液態(tài)菌種的生長趨勢(shì)影響作進(jìn)一步的闡 述。
[0021 ] 1.不同碳源對(duì)松茸菌絲體生長趨勢(shì)的影響 將松樹枝200克、土豆200克加水1500mL進(jìn)行混合、煮沸并保持30分種，然后過濾、冷卻 制得濾液； 分別向lOOOmL所述濾液中加入20g的作為碳源的乳糖、蔗糖、玉米粉和果糖，充分溶解 后取150mL裝入培養(yǎng)瓶中，然后向所述培養(yǎng)瓶加入15克洗凈烘干谷殼、0.3克KH2P〇4、0.3克 MgS04和0.5克檸檬酸，然后利用該培養(yǎng)基對(duì)所述松茸原種進(jìn)行培養(yǎng)5天，以考察不同碳源對(duì) 所述松茸菌絲體生長趨勢(shì)的影響。
[0022] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，從表中可以看出，影響所述松茸液態(tài)菌絲體生長趨勢(shì)的碳源 從大到小依次為蔗糖、玉米粉、果糖、乳糖，因此優(yōu)選蔗糖作為松茸液態(tài)菌種培養(yǎng)基的碳源； 同時(shí)還可以看出當(dāng)培養(yǎng)基中只有碳源沒有氮源情況下，松茸液態(tài)菌絲體生長趨勢(shì)較緩慢。
[0023] 表1.不同碳源對(duì)松茸液態(tài)菌絲體生長趨勢(shì)的影響
2. 不同氮源對(duì)菌絲體生長趨勢(shì)的影響。
[0024]將松樹枝200克、土豆200克加水1500mL進(jìn)行混合、煮沸并保持30分種，然后過濾、 冷卻制得濾液； 分別向lOOOmL所述濾液中加入20g的作為氮源的酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、豆粉、尿素， 充分溶解后取150mL裝入培養(yǎng)瓶中，然后向所述培養(yǎng)瓶加入15克洗凈烘干谷殼、0.3克 KH2P〇4、0.3克MgS〇4和0.5克檸檬酸，然后利用該培養(yǎng)基對(duì)所述松茸原種進(jìn)行培養(yǎng)5天，以考 察不同碳源對(duì)所述松茸菌絲體生長趨勢(shì)的影響。
[0025] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，從表中可以看出，影響所述松茸液態(tài)菌絲體生長趨勢(shì)的氮源 從大到小依次為豆粉、牛肉膏、酵母膏、尿素、蛋白胨，因此優(yōu)選豆粉作為松茸液態(tài)菌種培養(yǎng) 基的氣源。
[0026] 表2.培養(yǎng)基中不同氮源對(duì)松茸液態(tài)菌絲體生長趨勢(shì)的影響
3. 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)松茸菌絲體生長趨勢(shì)的影響。
[0027] 在液態(tài)發(fā)酵過程中，由于培養(yǎng)基成分不斷發(fā)生變化，因此通常只控制培養(yǎng)基的初 始pH值。
[0028] 本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)施例1中所述松茸液態(tài)菌種培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別采用20g蔗糖 和20g豆粉作為所述培養(yǎng)基的碳源和氮源，然后通過調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)基中的KH 2P04、MgS04、檸 檬酸成分比例進(jìn)行調(diào)控所述培養(yǎng)基的pH值。然后分別利用pH值為5、6、7的所述松茸液態(tài)菌 種培養(yǎng)基對(duì)所述松茸原種培養(yǎng)5天，以考察初始pH值對(duì)松茸菌絲體生長趨勢(shì)的影響。
[0029] 試驗(yàn)結(jié)果如表3