假單胞菌（Pseudomonas protegens）S63及其在防治水葫蘆中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001 ] 本發(fā)明屬于生物防治領(lǐng)域，具體設(shè)及假單胞菌(Pseudomonas p;rotegens)S63及其 在防治水葫蘆中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 水葫蘆又名鳳眼蓮，英文俗名為Water hya cin化，學(xué)名[Eiclihornia crassioes (Ma;rt. )Solms.]，屬單子葉植物綱（Monocotyledoneae)百合目化iliflorae)雨久花科 (Pontederiaceae)鳳眼蘭屬。水葫蘆原產(chǎn)南美洲，具有耐堿性、耐肥、抗污染力強(qiáng)、天敵少、 抗病力強(qiáng)、入侵能力強(qiáng)等生長特性。廣泛分布于河流、湖泊和水塘中，覆蓋水面，堵塞河道， 影響航運(yùn)及水上作業(yè)；同時(shí)，降低陽光對水體的穿透力，影響水底生物生長，并增加水體二 氧化碳濃度，影響水產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，并對當(dāng)?shù)鼐用耧嬎⒔】翟斐赏{。2003年我國環(huán) 保局將水葫蘆列為首批最危險(xiǎn)的16種外來入侵物種之一。
[0003] 國內(nèi)外開展與水葫蘆的斗爭已經(jīng)長達(dá)數(shù)十年之久，目前主要W打拱和化學(xué)藥劑處 理為主。我國各地面對泛濫成災(zāi)的水葫蘆主要還是采用人工和機(jī)械方式進(jìn)行打拱，不但耗 費(fèi)了大量的人力、物力，而且在水葫蘆爆發(fā)期還會(huì)出現(xiàn)打拱速度跟不上繁殖速度的現(xiàn)象。國 際上也有用除草劑來控制水葫蘆的。目前，研究和應(yīng)用較多的化學(xué)除草劑有2,4-D、敵草快、 百草枯和農(nóng)達(dá)等。運(yùn)些化學(xué)除草劑防除水葫蘆見效快，但很多國家并沒有接受運(yùn)種治理方 法。首先，成本太高，對一些經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)的國家來說是不適用的。其次，對水體生態(tài)環(huán)境破壞 性大。此外，由于水葫蘆繁殖速度快，一旦有新的來源又會(huì)快速生長，所W控制效果不能夠 持久。
[0004] 近年來，利用植物病害菌防治水葫蘆的生物防治的方法成為水葫蘆治理的一個(gè)熱 點(diǎn)研究領(lǐng)域，生物防治法具有成本低、效果長效和對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。但水葫蘆病原菌大部 分都為致病真菌，很少有關(guān)于水葫蘆致病細(xì)菌的研究報(bào)道。此外，研究表明水體的富營養(yǎng)化 是導(dǎo)致水葫蘆迅速繁殖的主要原因，消除水體富營養(yǎng)化是防治水葫蘆的根本措施。因此既 能抑制水葫蘆生長又能降解水體氨氮等污染物的微生物及其代謝物對水葫蘆泛濫具有標(biāo) 本兼治的防治作用。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種對水葫蘆具有良好的生物防治效果的假單胞菌 (Pseudomonas p;rotegens)S63,該菌于2015年11月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中屯、（CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，其保藏編號為： CGMCC No.11661。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了假單胞菌（Pseudomonas p;rotegens)S63在防治水 葫蘆中的應(yīng)用。
[0007] 所述的應(yīng)用優(yōu)選是在制備防治水葫蘆制劑中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的第Ξ個(gè)目的是提供一種防治水葫蘆制劑，其特征在于，含有有效量的假 單胞菌（Pseudomonas protegens)S63作為活性成分。
[0009]本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供假單胞菌（Pseudomonas p;rotegens)S63在凈化富營 養(yǎng)化水體中的應(yīng)用。
[0010] 所述的應(yīng)用優(yōu)選是在制備凈化富營養(yǎng)化水體制劑中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種凈化富營養(yǎng)化水體制劑，其特征在于，含有有效 量的假單胞菌(Pseudomonas p;rotegens)S63作為活性成分。
[0012] 本發(fā)明的假單胞菌(Pseudomonas p;rotegens)S63經(jīng)初步研究表明對水葫蘆具有 選擇性致病性，同時(shí)對富營養(yǎng)化水體亦具有較好的凈化效果，對水葫蘆的防治可取到標(biāo)本 兼治的功效，為水葫蘆的生物防治提供了一種新的思路和方法，具有推廣應(yīng)用的價(jià)值。
[0013] Pseudomonas protegens S63于2015年11月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中屯、（CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，其保藏編號為： CGMCC No.11661。
【附圖說明】：
[0014] 圖1是對照組和實(shí)驗(yàn)組葉片中的超氧化物歧化酶、丙二醒和過氧化氨酶的酶活；
[001引圖2是實(shí)驗(yàn)組和對照組在112小時(shí)內(nèi)的氨氮和COD的降解曲線。
【具體實(shí)施方式】：
[0016] W下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0017]實(shí)施例1:
[001引 （1)菌株篩選
[0019] 取水葫蘆病株的葉片，用次氯酸溶液擦洗，無菌水沖洗Ξ遍，研磨，取汁，涂布于水 葫蘆瓊脂平板培養(yǎng)基上。從水葫蘆病株所處的水體中，取ImL水樣涂布在水葫蘆瓊脂平板培 養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-4d。挑取單菌落，并進(jìn)行菌株純化，將純化后的菌株，保存在PDA 斜面。
[0020] 將純化菌株點(diǎn)種于氨氮平板培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2-4d，挑取保存產(chǎn)生透明圈的菌 株。
[0021] 取正常生長的水葫蘆植株，用70%酒精反復(fù)擦洗其莖部表面，無菌水沖洗數(shù)次，剪 取約5cm長的小段，置于墊有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，加入少許無菌水，W保持一定的濕度， 將初篩獲得的純化菌株接種于水葫蘆莖處，置室溫培養(yǎng)，選取能致水葫蘆莖部出現(xiàn)黑斑的 菌株。將上述篩選獲得的菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)2-4d，按0.5 %-2.5 %比例吸取 菌液加入到改良霍格蘭氏營養(yǎng)液中，再在其中移入生長正常的水葫蘆植株，同時(shí)W不添加 菌液作為空白對照，均設(shè)立Ξ組平行對照。于25°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15-20d，記錄觀察結(jié) 果。選取對水葫蘆生長具有最強(qiáng)抑制效果的菌株，命名為菌株S63。
[0022] 所用培養(yǎng)基：
[0023] 水葫蘆瓊脂平板培養(yǎng)基:水葫蘆莖40-60g，加少許水磨碎取汁，加瓊脂20g，用自 來水定容到1000ml，滅菌備用。
[0024] PDA培養(yǎng)基:馬鈴馨l(fā)OOg，葡萄糖lOg，瓊脂2g，蒸饋水1000ml，滅菌備用。
[0025] 氨氮平板培養(yǎng)基：巧樣酸Ξ鋼3g，NH祉P〇4 0.4g，K此P〇4 Ig，化Cl 3g，瓊脂20g，蒸 饋水1000ml，抑7.2-7.4,滅菌備用。
[00%]發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白腺0.5g，酵母膏1.5g，葡萄糖5g，脈0.2克，硫酸儀0.1克，K抽P〇4 0.1邑，船(：10.5邑，自來水10001111，抑7.2，滅菌備用。
[0027]改良霍格蘭氏營養(yǎng)液配方：四水硝酸巧945mg/L，硝酸鐘506mg/L，硝酸錠80mg/L， 憐酸二氨鐘136mg/L，硫酸儀493mg/L，鐵鹽溶液2.5ml/L，微量元素液5ml/L，抑=6.0，溶劑 為水。
[00巧]鐵鹽溶液配方:屯水硫酸亞鐵2.78g，乙二胺四乙酸二鋼化DTA.化)3.73g，蒸饋水 500ml，抑=5.5。
[0029] 微量元素液配方:艦化鐘0.83mg/l，棚酸6.2mg/L，硫酸儘22.3mg/L，硫酸鋒8.6mg/ L，鋼酸鋼0.25mg/L，硫酸銅0.025mg/L，氯化鉆0.025mg/L，溶劑為水。
[0030] (2)菌株鑒定
[00川將培養(yǎng)3d的菌株S63接種到40mL LB培養(yǎng)液的Ξ角瓶（lOOmL)中，于35°C、160r/ min，恒溫振蕩培養(yǎng)4她后制成菌體懸浮液，離屯、收集菌體，采用CTAB/化Cl法提取菌株基因 組DM。采用細(xì)菌通用引物27F(5 '-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '）和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對提取的DM進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物送至上海生工生 物有限公司進(jìn)行純化測序，其16S rRNA的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。用BLAST軟件與 NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的的16S rRNA序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明菌株S63與Pseudomonas protegens strain Azil5的同源性最高，相似性達(dá)99%。確定S63屬于假單胞菌，命名為假 單胞菌(Pseudomonas p;rotegens)S63，該菌于2015年11月16日保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中屯、（CGMCC)，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路