一種免增菌的李斯特菌培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及檢驗(yàn)微生物培養(yǎng)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種免增菌的單增李斯特菌培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 李斯特菌(也稱李氏桿菌)為革蘭氏陽性短桿菌，目前國際上公認(rèn)的李斯特菌共有 屯個(gè)菌株，其中單增李斯特菌化.mono^tohenes，LM)是唯一能引起人類疾病的。LM是一種 人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和 單核細(xì)胞增多。LM為兼性厭氧、無芽胞，一般不形成芙膜，但在營養(yǎng)豐富的環(huán)境中可形成芙 膜。LM培養(yǎng)最適培養(yǎng)溫度為35--37°C，在抑弱堿性(PH9.6)、氧分壓低、二氧化碳張力高的條 件下該菌生長(zhǎng)良好。
[0003] 雖然LM的營養(yǎng)要求不高，但由于LM的兼性厭氧和苛養(yǎng)性質(zhì)，如樣本中混有雜菌，且 抑中性、常規(guī)空氣條件下培養(yǎng)時(shí)，則會(huì)發(fā)生因需氧雜菌生長(zhǎng)過快而很快覆蓋了培養(yǎng)基，單增 李斯特菌無法生長(zhǎng)，結(jié)果延誤診療時(shí)間。除此之外，LM在pH中性、常規(guī)空氣狀態(tài)下培養(yǎng)時(shí)，其 生長(zhǎng)速度較慢，一般要48~7化才會(huì)有陽性菌落生長(zhǎng)，脈液或者糞便樣品則往往還要樣品先 轉(zhuǎn)種于增菌培養(yǎng)液(EB)中培養(yǎng)2地，然后取增菌液劃線接種培養(yǎng)4她，方能有陽性菌落生長(zhǎng)。 由于上述苛養(yǎng)性質(zhì)，導(dǎo)致臨床對(duì)于疑似LM要求保留樣本7d，W防止漏診。但上述時(shí)間（7化） 限制了 LM培養(yǎng)結(jié)果在臨床診斷上的應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是針對(duì)W上現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種配制簡(jiǎn)單、檢出率高、免 增菌的單增李斯特菌培養(yǎng)基。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題的技術(shù)方案是:一種免增菌的李斯特菌培養(yǎng)基，其特征為， 每1L培養(yǎng)基原料中含有蛋白腺6~lOg;牛肉膏3~6g;酵母浸膏2~5g;玉米淀粉2~3g，瓊脂 10~12g;氯化鋼5~5.5g;憐酸二氨鋼1~3g;多粘菌素0.001~0.005g;桿菌膚0.001~ 0.003g;葡萄糖酸鋒0.01~0.02g; 丫 -徑基精氨酸0.05~0.1 g;無菌抗凝羊血20~30g;余量為 滅菌去離子水。
[0006] 上述培養(yǎng)基的制備方法為:稱取蛋白腺、牛肉膏、酵母浸膏、玉米淀粉、瓊脂、氯化 鋼、憐酸二氨鋼，混勻后去離子水溶解，210°C滅菌15min，冷卻到45°C，加入滅菌多粘菌素； 滅菌桿菌膚;滅菌葡萄糖酸鋒;滅菌γ -徑基精氨酸;無菌抗凝羊血混勻，滅菌去離子水定容 到1L后分裝。
[0007] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，具有檢出可靠、單增李斯特菌分離率高的特點(diǎn)。配方特 點(diǎn)如下： 1、基礎(chǔ)培養(yǎng)基:所述的牛肉膏、蛋白腺、玉米淀粉提供碳源、氮源，酵母浸膏富含蛋白 質(zhì)、氨基酸、多膚、核巧酸、維生素、生長(zhǎng)因子、微量元素等營養(yǎng)成分，為單增李斯特菌的繁殖 和生長(zhǎng)提供均衡的營養(yǎng)元素;氯化鋼維持均衡的滲透壓;瓊脂為培養(yǎng)基的凝固劑;憐酸二氨 鋼為緩沖劑;無菌抗凝羊血提供能量環(huán)境； 2、 抑菌劑:多粘菌素抑制革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng);桿菌膚(Bacitracin),實(shí)驗(yàn)室研究表明 桿菌膚可W抑制革蘭陽性和陰性球菌、肺炎雙球菌、葡萄球菌、淋球菌、腦膜炎雙球菌等雜 菌的生長(zhǎng)，但該濃度下由于對(duì)李斯特菌屬無抗菌抑菌作用，因此提高了 LM的分離率； 3、 生長(zhǎng)因子:通過實(shí)驗(yàn)將同一 LM菌株接種到2個(gè)MMA培養(yǎng)基上，其中一個(gè)MMA培養(yǎng)基添加 0.01%滅菌光谷甘膚，于37°C、PH7.0、空氣氣氛下培養(yǎng)，48小時(shí)后觀察菌株，發(fā)現(xiàn)添加光谷甘 膚的MMA培養(yǎng)基有小的疑似菌落，鑒定后為L(zhǎng)M，沒有添加光谷甘膚的MMA培養(yǎng)基未發(fā)現(xiàn)LM疑 似菌落，其原因可能在于光谷甘膚可W降低氧化還原電勢(shì)，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)、分化； 4、 特殊營養(yǎng)劑：葡萄糖酸鋒為營養(yǎng)劑，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入一定濃度的鋒離 子，目標(biāo)菌LM的生長(zhǎng)狀態(tài)好于對(duì)照組，因此推論鋒離子有助于該菌的生長(zhǎng);而丫 -徑基精氨 酸為激活劑，可W促進(jìn)單增李斯特菌對(duì)礦物質(zhì)的攝取。
【具體實(shí)施方式】
[0008] W下結(jié)合實(shí)際情況，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0009] 實(shí)施例1，每1L培養(yǎng)基原料中含有:蛋白腺6g;牛肉膏6g;酵母浸膏2g;玉米淀粉3g， 瓊脂lOg;氯化鋼5g;憐酸二氨鋼3g;多粘菌素0.00 Ig;桿菌膚0.003g;光谷甘膚0.5g;無菌抗 凝羊血20g;余量為滅菌去離子水。上述培養(yǎng)基的制備方法為:稱取蛋白腺、牛肉膏、酵母浸 膏、玉米淀粉、瓊脂、氯化鋼、憐酸二氨鋼，混勻后去離子水溶解，210°C滅菌15min，冷卻到45 °C，加入滅菌多粘菌素;滅菌桿菌膚;滅菌光谷甘膚;無菌抗凝羊血混勻，滅菌去離子水定容 到1L后分裝。
[0010] 實(shí)施例2,每1L培養(yǎng)基原料中含有:蛋白腺8g;牛肉膏4g;酵母浸膏3g;玉米淀粉2g， 瓊脂1 Ig;氯化鋼5.5g;憐酸二氨鋼Ig;多粘菌素0.003g;桿菌膚0.002g;葡萄糖酸鋒0.02g; 丫 -?基精氨酸0.1 g;無菌抗凝羊血25g;余量為滅菌去離子水。上述培養(yǎng)基的制備方法為： 稱取蛋白腺、牛肉膏、酵母浸膏、玉米淀粉、瓊脂、氯化鋼、憐酸二氨鋼，混勻后去離子水溶 解，210°C滅菌15min，冷卻到45°C，加入滅菌多粘菌素;滅菌桿菌膚;滅菌葡萄糖酸鋒;滅菌 丫-徑基精氨酸;無菌抗凝羊血混勻，滅菌去離子水定容到1L后分裝。
[0011] 實(shí)施例3,每1L培養(yǎng)基原料中含有：蛋白腺lOg;牛肉膏3g;酵母浸膏5g;玉米淀粉 2g，瓊脂12g;氯化鋼5g;憐酸二氨鋼2g;多粘菌素0.005g;桿菌膚0.0 Olg;光谷甘膚0.1 g;葡 萄糖酸鋒O.Olg; 丫 -徑基精氨酸〇.〇5g;無菌抗凝羊血30g;余量為滅菌去離子水。上述培養(yǎng) 基的制備方法為:稱取蛋白腺、牛肉膏、酵母浸膏、玉米淀粉、瓊脂、氯化鋼、憐酸二氨鋼，混 勻后去離子水溶解，210°C滅菌15min，冷卻到45°C，加入滅菌多粘菌素;滅菌桿菌膚;滅菌光 谷甘膚;滅菌葡萄糖酸鋒;滅菌丫 -徑基精氨酸;無菌抗凝羊血混勻，滅菌去離子水定容到1L 后分裝。
[0012] 本發(fā)明所得單增李斯特菌培養(yǎng)基具有檢出可靠、單增李斯特菌分離率高的特點(diǎn)， 為臨床資料充分證明，有關(guān)資料如下。
[001引 1對(duì)象與方法。
[0014] 1.1培養(yǎng)基制備:實(shí)驗(yàn)組共設(shè)I、II、IIΙΞ個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別使用實(shí)施例1、實(shí)施例2、 實(shí)施例3所得培養(yǎng)基，對(duì)照組為李氏菌選擇性培養(yǎng)基(MMA)，其成分(g/L):膜蛋白腺5.0;多 價(jià)腺5.0;牛肉浸粉3.0;葡萄糖1.0;氯化鋼5.0;憐酸氨二鋼1.0;甘氨酸10.0;氯化裡0.5;苯 乙醇2.5;瓊脂15.0;蒸饋水定容為1L，分裝傾入無菌平皿備用。
[0015] 1.2菌株來源及菌懸液的制備:LM標(biāo)準(zhǔn)菌株由市疾控中屯、菌種保藏室提供，常規(guī) 復(fù)蘇增菌分純后制成100 CFU/ml的LM菌懸液。
[0016] 1.3糞便樣本處理:取20份糞便樣本懸浮液2ml，分別加入LM菌懸液2ml，混勻。
[0017] 1.4接種及培養(yǎng):分別取LM菌懸液和處理后的糞便樣本，各自用接種環(huán)分區(qū)劃線 接種于實(shí)驗(yàn)I組、實(shí)驗(yàn)II組、實(shí)驗(yàn)III組和對(duì)照組培養(yǎng)基。35°C下，大氣環(huán)境保溫培養(yǎng)，觀察菌 落生長(zhǎng)特征，分別于4她和96h，挑取細(xì)小菌落進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，顯微鏡鏡檢及氧化氨 酶實(shí)驗(yàn)，行菌屬鑒定及巧光定量PCR檢測(cè)。其中菌屬鑒定陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)依從《臨床微生物學(xué) 診斷與圖解》。
[001引2結(jié)果： 2.1 LM菌懸液培養(yǎng)結(jié)果比較:培養(yǎng)4她及96h陽性檢出情況見下表，
上述結(jié)果可W看出，培養(yǎng)4她后，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組陽性檢出率比較均具有明顯差異(P <0.05)，而96h時(shí)，各組間陽性檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〉0.05)。
[0019] 2.2 LM菌懸液處理后的糞便樣本培養(yǎng)結(jié)果比較:培養(yǎng)4她及9加陽性檢出情況見下 表，
' 上述結(jié)果可W看出，混有雜菌的?Μ樣本，培養(yǎng)4她后，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組陽性檢出率比I 較均具有極其顯著的差異(Ρ<〇.01)，9化時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組陽性檢出率高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義(Ρ〉〇.〇5)。
[0020] 3.結(jié)論:本發(fā)明的培養(yǎng)基無需額外增菌，也能夠在4她的時(shí)間點(diǎn)得到高效的陽性檢 出率，提高大氣培養(yǎng)環(huán)境下早期陽性分離率，從而縮短確診時(shí)間。尤其是對(duì)于糞便等含有雜 菌的樣本，可W緩解雜菌對(duì)于單增李斯特菌陽性生長(zhǎng)的不良影響，增加分離率。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種免增菌的李斯特菌培養(yǎng)基，其特征在于，每1L培養(yǎng)基原料中含有蛋白胨6~log; 牛肉膏3~6g;酵母浸膏2~5g;玉米淀粉2~3g，瓊脂10~12g;氯化鈉5~5.5g;磷酸二氫鈉1 ~3g;多粘菌素0.001~0.005g;桿菌肽0.001~0.003g;;葡萄糖酸鋅0.01~0.02g; γ -羥基 精氨酸〇. 05~0. lg;無菌抗凝羊血20~30g;余量為滅菌去離子水。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種免增菌的李斯特菌培養(yǎng)基，屬于檢驗(yàn)微生物培養(yǎng)領(lǐng)域，每1L培養(yǎng)基原料中含有蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、玉米淀粉、瓊脂、氯化鈉、磷酸二氫鈉、多粘菌素、桿菌肽、葡萄糖酸鋅、γ-羥基精氨酸、無菌抗凝羊血、滅菌去離子水。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，具有早期陽性分離率高的特點(diǎn)。
【IPC分類】C12R1/01, C12N1/20
【公開號(hào)】CN105505838
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610080035
【發(fā)明人】李志友, 孫麗華
【申請(qǐng)人】李志友
【公開日】2016年4月20日
【申請(qǐng)日】2016年2月5日