動物糞便宏基因組來源的低溫鄰苯二酚1,2-雙加氧酶、其編碼基因及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種動物糞便宏基因組來源的低溫鄰苯 二酪1,2-雙加氧酶、其編碼基因及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 芳香族化合物是地球上僅次于碳水化合物的第二大類有機(jī)碳源，在自然界中廣泛 存在。鄰苯二酪是微生物代謝酪類和大多數(shù)多環(huán)芳香族化合物的中間產(chǎn)物，鄰苯二酪的進(jìn) 一步裂解對多環(huán)芳控是否能徹底降解起著重要作用。鄰苯二酪1 ,2-雙加氧酶（EC 1.13.11.1)是催化鄰苯二酪鄰位氧化開環(huán)的關(guān)鍵芳環(huán)加氧酶，該酶催化鄰苯二酪裂解形成 中間物一一順，順-己二締二酸，并在后續(xù)酶促反應(yīng)中進(jìn)一步被降解進(jìn)入Ξ簇酸循環(huán)，因此 鄰苯二酪1,2-雙加氧酶在微生物降解多種芳香族化合物的過程中有著重要作用。此外，該 酶催化鄰苯二酪裂解形成的中間產(chǎn)物順，順-己二締二酸是一種精細(xì)化工原料，可用于生產(chǎn) 特殊性能的工程塑料、樹脂、尼龍等，W及合成抗菌素、抗阻胺劑、乳化劑等。
[0003] 因此，近年來Acinetobacte;r[Lin et al .Protein J,2015,34(6) :421-433]、 Arthrobacter[Eck et al. Gen ,1993,123( 1):87-92]、Corynebacterium[Shen et al.Biotechnol Lett,2004,26(7):575-580]、Pseudomonas[Kim et al.J Basic Microbiol,2015,55(3):354-362;Kaneko et al.Chem Lett,2011,40:381-383]、 Rhodocococcus[Strachan et al.Biochem J,1998,333:741-747,Murakami et al.Gene, 1997,185(1):49-54]和Streptomyces[An et al.FEMS Microbiol Lett,2001,195(1):17-22]等多種細(xì)菌的鄰苯二酪1，2-雙加氧酶基因相繼被克隆、表達(dá)并鑒定。低溫鄰苯二酪1，2-雙加氧酶在低溫環(huán)境中具有較高的酶活，可用于低溫環(huán)境中芳香族化合物的降解，相對于 中溫或高溫鄰苯二酪1,2-雙加氧酶有其特有的應(yīng)用優(yōu)勢。此外，將中溫或者高溫條件下順， 順-己二締二酸的生產(chǎn)過程轉(zhuǎn)為低溫加工過程還可起到降低能耗的作用。然而，目前利用常 規(guī)微生物培養(yǎng)法從上述細(xì)菌克隆得到的鄰苯二酪1,2-雙加氧酶最適作用溫度一般為30~ 40°C，僅Pseudomonas SP.PAMC 25931來源的鄰苯二酪1,2-雙加氧酶的最適作用溫度為25 °C，但是該酶溫度穩(wěn)定性較差，37°C下耐受化酶活完全喪失，25°C下耐受化酶活損失35% [Kim et al.J Basic Microbiol，2015,55(3):354-362]。
[0004] 動物尤其是植食性動物由于廣泛攝食各種植物，其胃腸道是木質(zhì)素及其相關(guān)酪類 物質(zhì)降解的環(huán)境，同時(shí)通過環(huán)境互作對環(huán)境污染物的代謝，使得在長期進(jìn)化過程中通過適 應(yīng)和自然選擇，其胃腸道中可能存在參與芳香族化合物代謝的功能基因。然而，傳統(tǒng)的微生 物純培養(yǎng)技術(shù)使得占微生物種類99% W上的不可培養(yǎng)微生物無法分離獲得，因此通過分離 培養(yǎng)微生物來篩選新型酶的傳統(tǒng)方法大大限制了篩選的廣泛性和有效性。宏基因組學(xué)避開 了微生物分離培養(yǎng)的問題，極大地?cái)U(kuò)展了微生物資源的利用空間，為尋找和發(fā)現(xiàn)新的功能 基因及生物催化劑一一酶提供了新的研究策略。
[0005] 近年來利用宏基因組技術(shù)從環(huán)境中獲取芳香族化合物代謝酶類的研究主要集中 在±壤、活性污泥和污水等環(huán)境樣品，對動物胃腸道環(huán)境樣品的研究匿乏[Beloqui et al.J Biol Chem,2006,281(32):22933-22942；Fang et al.PLoS One ,2012,7(11): e50312]，且未見有胃腸道來源的鄰苯二酪1，2-雙加氧酶的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種動物糞便宏基因組來源的低溫鄰苯二酪1,2-雙加氧 酶、其編碼基因及其制備方法，本發(fā)明提供的低溫鄰苯二酪1,2-雙加氧酶的最適作用溫度 較低，且溫度穩(wěn)定性較好。
[0007] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種動物糞便宏基因組來源的低溫鄰苯二酪1,2-雙 加氧酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共309個(gè)氨基酸，理論分子量為33.72kDa。
[0008] 本發(fā)明提供的動物糞便宏基因組來源的低溫鄰苯二酪1,2-雙加氧酶最適作用pH 為8.0，在抑7.0~9.0范圍內(nèi)處理化后，酶活剩余60% W上；最適作用溫度為25°C，具有低 溫酶的特性，在〇°C和10°C分別具有約30 %和60 %的酶活;該酶溫度穩(wěn)定性較好，25°C和37 °〇條件下耐受化對酶活無影響，25°C條件下耐受26h仍保持65% W上的酶活。本發(fā)明提供的 動物糞便宏基因組來源的低溫鄰苯二酪1,2-雙加氧酶所具有的良好的pH、溫度穩(wěn)定性和低 溫催化特性，可用于順，順-己二締二酸的酶法合成W及低溫環(huán)境中芳香族化合物的降解。
[0009] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種編碼上述技術(shù)方案所述的低溫鄰苯二酪1,2-雙 加氧酶的基因，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，基因大小為93化P。
[0010] 本發(fā)明的目的之Ξ在于提供一種包含上述技術(shù)方案所述的基因的重組表達(dá)載體， 優(yōu)選為祀asy-E2-ca巧L12。
[0011] 本發(fā)明的目的之四在于提供一種利用上述技術(shù)方案所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿 主細(xì)胞所得的重組菌株，所述菌株包括但不限于大腸桿菌、酵母菌、芽抱桿菌或乳酸桿菌， 優(yōu)選為重組菌株化21(DE3)/ca巧L12。
[0012] 本發(fā)明通過PCR的方法克隆到鄰苯二酪1,2-雙加氧酶基因 catPL12,將基因 cat化12與質(zhì)粒祀asy-E2連接得到重組表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌化2UDE3)獲得重組菌 株。
[0013] 本發(fā)明的目的之五在于提供一種上述技術(shù)方案所述的低溫鄰苯二酪1,2-雙加氧 酶的制備方法，包括W下步驟：
[0014] 將鄰苯二酪1,2-雙加氧酶基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞得到重組菌株，培養(yǎng) 重組菌株，誘導(dǎo)重組鄰苯二酪1，2-雙加氧酶表達(dá)；
[0015] 回收并純化所表達(dá)的鄰苯二酪1,2-雙加氧酶，得到低溫鄰苯二酪1,2-雙加氧酶。
[0016] 參見圖1，圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的低溫鄰苯二酪1,2-雙加氧酶的制備方法流程 圖。
[0017] 其中，所述鄰苯二酪1,2-雙加氧酶基因按照W下方法獲得：
[001引從倭蜂猴糞便中提取微生物基因組DNA;
[0019] ^所述微生物基因組0麻為模板，^沈9 10^).3所示的引物〇曰巧1^2。和569 10 NO. 4所示的引物ca巧L12R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到鄰苯二酪1，2-雙加氧酶基因。
[0020] 具體而言，所述鄰苯二酪1,2-雙加氧酶基因按照W下方法獲得：
[0021] 從倭蜂猴糞便中提取微生物基因組DNA，其提取方法可參照專利"一種從動物糞便 中提取高分子量基因組的方法"，公開號102586234A;
[0022] ^所述微生物基因組0魁為模板，^沈9 10^).5所示的引物打2〇。和沈9 10^.6 所示的引物Ci2〇R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所述PCR反應(yīng)參數(shù)為:94°C變性5min;然后94°C變性30sec，48 °C退火30sec，72°C延伸Imin，30個(gè)循環(huán)后72°C保溫7min。得到約43化P的基因片段，將基因 片段回收后與PMD19-T載體連接，送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，獲得鄰苯二 酪1，2-雙加氧酶基因片段Ci2〇15-d-13的核巧酸序列。
[0023] ^該鄰苯二酪1，2-雙加氧酶基因片段打2〇15-(1-13為核屯、序列，^569 10^.7所 示的引物此口1、56910側(cè).8所示的引物此口2、56910側(cè).9所示的引物此口3、56910側(cè).10 所示的引物(15口1、569 10顯.11所示的引物(15口2和56〇10肋.12所示的