一種血清外泌體中rna的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于RNA提取領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種血清外泌體中RNA的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 外泌體(exosome)是一種30-100nm大小、極低密度的細(xì)胞外納米級囊狀結(jié)構(gòu)，由細(xì) 胞經(jīng)過"內(nèi)吞-融合-外排"等一系列調(diào)控過程而形成。外泌體在被發(fā)現(xiàn)后的很長一段時間內(nèi) 都沒有引起研究者的注意，直到納米分析技術(shù)的引進(jìn)，W及2013年諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎的公 布，運個直徑只有幾十納米的顆粒受到了前所未有的重視。
[0003] 據(jù)研究報道，外泌體中含有的內(nèi)容物如微RNA(mRNA、miRNA)、蛋白質(zhì)和信號復(fù)合物 在受體細(xì)胞基因和蛋白表達(dá)調(diào)控中有重要作用。如血清外泌體中的miRNA(exosomal-miRNA)具有獨特的介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的功能，能特異性抑制祀細(xì)胞中的祀基因表達(dá)，因此與 游離miRNA相比，血清exosomal-miRNA水平的變化更加能代表惡性腫瘤的生物學(xué)功能的變 化。另外，腫瘤細(xì)胞衍生外泌體通過傳遞的miRNA還能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成。 目前，在腫瘤、生殖、血液和免疫等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，正開展一場與外泌體內(nèi)容物（如蛋白、 RNA)功能機(jī)制分析有關(guān)的前所未有的研究熱潮。
[0004] 由此可見，外泌體的成功分離及其內(nèi)容物的提取顯得尤其重要。傳統(tǒng)的外泌體分 離提取方法是使用超高速差速離屯、法，該方法操作簡單但不適合大量樣品的制備，因為效 率較為低下、易被污染。另外一種方法是超濾薦糖密度梯度離屯、法，該方法分離到的外泌體 純度高，但是前期準(zhǔn)備工作繁雜，耗時，量少。還有一種就是免疫磁珠分選，該方法可W保證 外泌體形態(tài)的完整，特異性高、操作簡單，但非中性抑和非生理性鹽濃度會影響外泌體生物 活性，不便進(jìn)行下一步實驗。目前，分離外泌體采用最多的方法是免疫共沉淀原理進(jìn)行的， 該方法操作簡便，能夠獲得高純度的外泌體樣本。典型代表有l(wèi)ife technology公司的 Total Exosome Isolation Reagent、SBI公司的ExoQuick和ExoQuick-TC。
[000引然而，現(xiàn)有的用于提取外泌體方法大多只是將外泌體運種完整的囊泡結(jié)構(gòu)提取出 來，但是囊泡內(nèi)的微RNAW及腫瘤相關(guān)抗原等激活免疫細(xì)胞的重要成分很難提取。原因是外 泌體本身性狀粘稠，極難打散，運導(dǎo)致在提取外泌體RNA的過程中，裂解液不易滲透進(jìn)去，致 使裂解很難充分，裂解時間長。
[0006] 目前，市場上用于提取外泌體RNA的試劑較少，life公司有專口提取的試劑盒，但 價格昂貴，且該試劑盒用的是柱式法提取外泌體RNA，該方法得到的RNA純度高，但存在一個 柱式法的普遍致命問題，就是柱式法損失量大，致使RNA提取量大大減少，該方法對于本身 含量極低的血清來源外泌體中RNA來說，無疑還不是一種最佳的選擇方法。除了柱式法，還 有另外一種經(jīng)典方法，就是常規(guī)的RNA沉淀法。該方法在外泌體RNA提取過程中，由于外泌體 極粘稠的性狀，使常規(guī)的RNA沉淀法同樣存在外泌體裂解時間長，極難充分裂解等問題。
[0007] 總而言之，不管采用哪種方法，血清中外泌體分離一直存在提取困難、提取量少、 提取費用昂貴等難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了一種血清外泌體中RNA 的提取方法，本發(fā)明的RNA的提取方法具有提取時間短、效率高、效果好、試驗成本低的優(yōu) 點。
[0009] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:一種血清外泌體中RNA的提取方法，包括W下步驟：
[0010] 1)提取血清中的外泌體；
[0011] 2)在超聲的作用下使用RNA提取試劑裂解步驟1)中提取的外泌體；
[0012] 3)使用氯仿將步驟2)得到的裂解后的外泌體中的RNA分離至水相；
[0013] 4)使用異丙醇沉淀步驟3)得到的水相中的RNA;
[0014] 5)使用乙醇洗涂步驟4)中沉淀的RNA，之后再次溶解RNA，即得所述血清外泌體中 的 RNA。
[0015] 優(yōu)選地，所述步驟1)中，使用Total Exosome Isolation試劑提取血清中的外泌 體。
[0016] 優(yōu)選地，所述步驟2)中，所述RNA提取試劑為Trigene。
[0017] 優(yōu)選地，所述步驟2)中，超聲的頻率為28-35Ifflz，超聲處理時間為2-3min。
[0018] 優(yōu)選地，所述步驟1)通過W下步驟實施：
[0019] 11)將血清放置冰上溶解，加入Total Exosome Isolation試劑，充分混勻后，靜置 冰上30min;
[0020] 12)4°C 離屯、，1500Xg，10min;
[0021] 13)移除所有上清，沉淀部分即為所述外泌體。
[0022 ]優(yōu)選地，所述步驟3)通過W下步驟實施：
[0023] 31)向步驟2)中裂解后的外泌體中加入氯仿，充分震蕩混勻，室溫靜置約2min;
[0024] 32) 4°C離屯、，10000 X g，lOmin;可見分為Ξ層，RNA在上層水相，轉(zhuǎn)移水相。
[0025] 優(yōu)選地，所述步驟4)通過W下步驟實施：
[0026] 41)向步驟3)得到的水相中加入異丙醇，輕柔充分混勻，-20°C靜置過夜，沉淀RNA;
[0027] 42)4°C 離屯、，12000 X g，15min;棄上清，即得沉淀的 RNA。
[0028] 優(yōu)選地，所述步驟5)通過W下步驟實施：
[0029] 51)用75 %乙醇洗涂步驟4)中沉淀的RNA; 4°C離屯、，12000 X g，5min;棄上清；
[0030] 52)加入DEPC水溶解沉淀，即可得到血清外泌體中的RNA。
[0031 ] 優(yōu)選地，所述的血清外泌體中RNA的提取方法，包括W下步驟：
[0032] A.將25化L血清放置冰上溶解，再加入50化To化1 Exosome Isolation試劑，用槍 輕輕吹打充分混勻后，靜置冰上30min;
[0033] B.4°C 離屯、，1500Xg，10min;
[0034] C.用槍頭盡量移除所有上清，沉淀部分即為外泌體；
[003引 D.將提取到的外泌體加入ImL化igene，在頻率為28-35K化的超聲波中超聲處理 2-3min，即可使粘稠的外泌體充分裂解；
[0036] E.加入200化氯仿，充分震蕩混勻約30s，使水相和有機(jī)相充分接觸，室溫靜置約 2min;
[0037] F. 4°C離屯、，10000 X g，lOmin;可見分為Ξ層，RNA在上層水相，移至另一新的 RNase-free EP管；
[0038] G.加入等體積的異丙醇，輕柔充分混勻，-20°C靜置過夜，沉淀RNA;
[0039] H. 4°C離屯、，12000 X g，15min;棄上清，可再稍加離屯、，吸去多余上清；
[0040] I.用75%乙醇洗涂兩次，須輕晃起沉淀物;4°C離屯、，12000 X g，5min;棄上清；
[0041 ] J.加入20-5化L DEPC水溶解沉淀，即可得到血清外泌體的RNA。
[0042] 相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：
[0043] 1)本方法加速了實驗流程:通過超聲波震蕩技術(shù)使粘稠的外泌體分離物的裂解時 間從30min縮短到5min左右，大大縮短了裂解時間，效果明顯；
[0044] 2)本方法節(jié)約了實驗成本：由于超聲波震蕩技術(shù)的應(yīng)用，使exosome-RNA的提取對 試劑的可選度加大，低成本的國產(chǎn)試劑Trigene就可W完成粘稠 exosomal分離物的快速裂 解，而不需要用到進(jìn)口試劑；
[0045] 3)本方法在提取工藝中使用超聲波震蕩技術(shù)，不用添加任何化學(xué)物質(zhì)，又克服了 引入不必要的外源性無機(jī)離子，工藝簡單，具有較好的實際應(yīng)用價值。
【具體實施方式】
[0046] 為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點，下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明 作進(jìn)一步說明。
[0047] W下實施例中RNA的含量的測定采用qPCR方法進(jìn)行，具體方法如下：
[0048] 首先按常規(guī)方法逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，然后進(jìn)行巧光定量PCR反應(yīng)，具體操作如下：
[0049] (1 )RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):將上述exosome中提取的RNA作為模板，在去腳ase的PCR管 中加入RNA模板（^Oyg)和RNA打ee出0至總體積為祉L
[0050] (2)將上述溶液混勻，70°C解育5min，隨后立即置于冰上急冷，W防止RNA復(fù)性再次 恢復(fù)二級結(jié)構(gòu)；
[0051 ] (3)在另一去RNase的PCR管中配置W下溶液(單位:μυ: lOmmQl/LdNTP: 2.0 5 X reaction buffer: 4.0 m化-197-3p-RT ( 10 μιτιοΙ/L ): 0,5 mi民-671 -5p-拔Γ ( 10 μηχαΙΑ): 0.5
[0052] miR-1246-RT ( 10 Limol/L): 0.5 miR-4436b-5p-RT (ΙΟμηιοΙ/L): 0.5 MgCb ( 25 mmol/L ): 2.0 RNase inhibilOr 化romega) : 0 5 M-MLV (200 U樹： 0.5
[005引 DEPC 化0: 叩 U) 12
[0054] (4)將3)中的溶液加入到1)的溶液中，混勻后42°C解育60min。
[005引 （5)70°C解育5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，即可獲得cDNA。
[0056] (6)按W下反應(yīng)體系對逆轉(zhuǎn)錄出的miRNA分別進(jìn)行qPCR檢巧Ij(單位:yL): cDNA ( 1:20 ): 2.0 Forward Primer ( 10 umol/L ): 0.5
[0057] Reverse Primer ( 10 μηιο1/Ι.): 化5 ZxSYB民 Green qPC民 SuperMix: 10.0 ddFbO: 巧）化 20.0
[0058] (7)qPCR反應(yīng)條件為：
[0059] 95°C，5min
[0060] 95°C，15s 一 50°C，30s共40個循環(huán)(在50°C收集巧光信號）
[0061] 95°C，15s 一 60°C，30s 一 95°C，15s (烙解曲線:在第二個 95°C 收集信號）
[0062] 實施例1
[0063] Exosome-RNA提取試齊Ij的篩選
[0064] 目前市場上用于提取exosome的試劑主要來自System Biosciences和1 if e technology運兩家公司，因此我們對比了兩家公司的3種產(chǎn)品在用于本項目血清樣本的 exosome提取方面的效果，包括SBI公司的ExoQuick(適用于血液)和Exo如ick-TC(適用于組