重組人肝細胞溶質(zhì)抗原Ⅰ真核表達載體構(gòu)建和表達方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程和生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種重組人肝細胞溶質(zhì)抗 原I真核表達載體構(gòu)建和表達方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自身免疫性肝病(ALD)是一類原因不明的、免疫介導(dǎo)的W肝臟為祀器官的自身免 疫性疾病，主要包括W肝細胞胞實質(zhì)損害為主的自身免疫性肝炎(autoimmune h巧atitis, AH)、和W膽管病變?yōu)橹鞯脑l(fā)性膽汁性肝硬化(prima巧billia巧cirrhosis,PBC)、原發(fā) 性硬化性膽管炎(primaiy sclerosing cholangitis,PSC)S組疾病。近年來由于對此類疾 病研究的不斷深入W及臨床上相關(guān)免疫學(xué)檢測試劑盒不斷涌現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)我國人群中ALD患者 不斷增多。
[0003] 抗肝細胞溶質(zhì)抗原I型抗體(anUbody to liver巧tosol 1 ,LC-1)是Π 型ALD的 一項重要血清學(xué)標志，主要存在于兒童和青少年患者中，一般年齡在20歲W下。亞胺甲基轉(zhuǎn) 移酶、環(huán)化脫氨酶和精氨基班巧酸裂解酶被確認是LC-1的祀抗原。LC-1抗體對自身免疫性 肝炎的特異性較高，但出現(xiàn)率較低，在大約10%的患者中抗LC-1抗體僅僅是Π 型ALD的血清 學(xué)標志。LC-1抗體出現(xiàn)在大約30%的Π 型ALD患者中，而且會和LKM-1(抗肝/腎微粒體抗原1 抗體)一起出現(xiàn)，約50-60%抗LKM-1抗體陽性患者同時抗LC-1抗體陽性。LC-1抗體滴度與疾 病活動程度、血清轉(zhuǎn)氨酶和丙種球蛋白水平明顯相關(guān)。高效價的抗-1X1只在有著高活動度 的慢性肝炎或肝硬化中檢測到。目前，LC-1抗原主要是利用陽性血清通過對流免疫電泳分 離得到的，但由于LKM-1和LC-1抗體往往同時存在，LC-1抗體獨特的間接免疫巧光圖案有可 能會被掩蓋住。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種重組人肝細胞溶質(zhì)抗原I真核表達載體構(gòu) 建和表達方法，得到人肝細胞溶質(zhì)抗原I融合蛋白及其編碼基因，實現(xiàn)利用真核表達系統(tǒng)高 效表達、生產(chǎn)重組人肝細胞溶質(zhì)抗原I。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個技術(shù)方案是：提供一種重組人肝細胞溶 質(zhì)抗原I真核表達載體構(gòu)建和表達方法，包括步驟為： (1) 合成人肝細胞溶質(zhì)抗原I基因； (2) 將所述人肝細胞溶質(zhì)抗原I基因經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消化后與經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消 化的真核表達載體在T4連接酶的作用下進行連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊α感受態(tài)細胞，經(jīng)過 鑒定得到帶有人肝細胞溶質(zhì)抗原I基因片段的重組載體； (3) 將鑒定后的所述重組載體轉(zhuǎn)染進入真核細胞中表達得到重組蛋白； (4) 對所述重組蛋白進行親和純化，得到目的蛋白。
[0006] 在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟(2)中所述真核表達載體是具有多克隆位點且 能通過多個調(diào)控原件在真核表達系統(tǒng)調(diào)控進而表達插入基因的分子生物學(xué)載體。
[0007]在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟(2)中所述真核表達載體是能通過信號膚進行 分泌表達或者不帶有信號膚進行胞內(nèi)表達的載體。
[000引在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟(2)中所述真核表達載體為PCDNA3.1(+)載體。
[0009] 在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟(3)中所述真核細胞是能表達外源基因的真核 細胞，所述真核細胞不局限于宿主細胞。
[0010] 在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟(3)中所述真核細胞為HEK293細胞系。
[0011] 在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟(3)中所述轉(zhuǎn)染為促進外源基因進入宿主細胞 的方法，所述轉(zhuǎn)染包括化學(xué)轉(zhuǎn)染和物理轉(zhuǎn)染。
[0012] 在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟(3)中所述轉(zhuǎn)染為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法。
[0013] 在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟(3)中所述純化為利用蛋白的物理性質(zhì)通過色 譜柱進行親和純化，得到目的蛋白。
[0014] 在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟(3)中所述純化為采用儀柱對目的蛋白進行純 化。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的重組人肝細胞溶質(zhì)抗原I真核表達載體構(gòu)建和表 達方法，能實現(xiàn)重組的LC-1抗原成功表達，使用重組的LC-1在免疫學(xué)檢測中能解決間接免 疫巧光圖案被遮蓋的問題。
【附圖說明】
[0016] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使 用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可W根據(jù)運些附圖獲得其它 的附圖，其中： 圖1是本發(fā)明中口。0臟3.1(+)/扣111曰111(：-1重組質(zhì)?；?巧郵曰11^1雙酶切鑒定圖，其中1 為DNAMarker，泳道l為pcDNA3.1(+)AumanLC-l重組質(zhì)粒Mle巧郵amHI雙酶切； 圖2是本發(fā)明中人LC-1基因融合的陰性血清和陽性血清Western blot分析圖，泳道1為 陰性血清，泳道2為陽性血清，Μ為Marker。
【具體實施方式】
[0017] 下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施 例僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護的范 圍。
[001引實驗材料； 菌株、細胞和載體：大腸桿菌DH5a、HEK293細胞系和PCDM3. 1( + )載體均購自 Invitrogen 公司。
[0019]酶與試劑:限制性內(nèi)切酶和T4連接酶為Thermo公司產(chǎn)品。
[0020]生化試劑：0PTI-MEMI reduced serum medium，Lipofectamine 2000，TRIzol試劑 購自Invihogen公司；DMEM高糖型培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青公 司；His tag抗體購自Cell Si即aling化chnology公司；E化化學(xué)發(fā)光試劑盒購自化ermo公 司；大腸桿菌培養(yǎng)基為LB，其含有質(zhì)量體積比(w/v)為1%的蛋白腺、質(zhì)量體積比(w/v)為ο. 5% 的酵母提取物、質(zhì)量體積比(w/v)為1%的化C1，抑值為7.0,膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒 和去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)megabiotek公司。
[0021] 實施例一； 人LC-1基因人工合成 根據(jù)GenBank已公開的人Formimidoyltransferase-cyclodeaminase 邑ene的mRNA序列 (GenBank序列登錄號:AF289024)，在該基因的5'端添加 Nhel酶切位點，在該基因的3'端的 終止密碼子之前添加適用于后續(xù)融合蛋白純化的6X化S標簽的基因序列，在3'端的終止密 碼子之后添加 BamH I酶切位點，見SEQ ID N0.1，氨基酸序列見SEQ ID N0.2。
[0022] 實施例二 帶有人LC-1基因的重組PCDNA3.1(+)的構(gòu)建 (l)Human LC-1 基因雙酶切：LC-1(質(zhì)粒）2yg、MieI 2yl、BamH I 化l、10XfastDigest buffer 化1，增加 dd出0至50.0μ1，混勻，12000rpm離屯、5秒，37°C酶切30min。
[0023] (2)載體雙酶切：PCDNA3.U+)載體化g、NheI 2yl、BamH I 化UlOXfastDigest buffer 化1，增加 dd出0至50.0μ1，混勻，12000rpm離屯、5秒，37°C酶切30min。
[0024] (3)使用試劑盒回收雙酶切產(chǎn)物:酶切產(chǎn)物加10μ1 eXLoading buffer、質(zhì)量體積 tt (w/v)為1.0%的瓊脂糖凝膠(含邸）電泳30min，經(jīng)回收，得到human LC-1基因和PCDNA3.1 (+)載體的酶切產(chǎn)物。
[0025] (4)連接反應(yīng)（1化1體系）:LC-1基因酶切產(chǎn)物7.扣1、pcDNA3.1 (+)載體的酶切產(chǎn)物 1μ1、10 X T4連接酶buf f