一種提高l-蘇氨酸轉(zhuǎn)化率的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程和微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及通過增強合 適的蘇氨酸生產(chǎn)菌株中的丙麗酸駿化酶和天冬氨酸激酶的酶活來提高k蘇氨酸的轉(zhuǎn)化率 的方法；丙麗酸駿化酶和天冬氨酸激酶得到增強的轉(zhuǎn)化率提升的k蘇氨酸生產(chǎn)菌株；W及 本發(fā)明還涉及該菌株的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] k蘇氨酸是人類和動物營養(yǎng)中最重要的必需氨基酸，在食品工業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和飼料 工業(yè)中有著十分重要的地位。近年來，其市場需求穩(wěn)步增加，世界市場銷售量已經(jīng)突破百萬 噸規(guī)模。目前，蘇氨酸主要采用微生物發(fā)酵法來生產(chǎn)。在大腸桿菌中心蘇氨酸的合成途徑 是W天冬氨酸為前體，通過五步反應(yīng)生產(chǎn)蘇氨酸（如圖1所示）。
[0003] 工業(yè)上主要由大腸桿菌進行發(fā)酵生產(chǎn)。由于蘇氨酸在經(jīng)濟生活中的重要性，研究 人員不斷對生產(chǎn)蘇氨酸的大腸桿菌進行改造。目前的蘇氨酸生產(chǎn)菌株主要通過誘變，篩選 等方法來進行改善，但近些年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，代謝工程技術(shù)越來越多地應(yīng)用 于蘇氨酸大腸桿菌改造。
[0004] 目前已經(jīng)有許多報道通過改造大腸桿菌的基因來提高k蘇氨酸的產(chǎn)量的方法。 EP1687408A1報道了將大腸桿菌蘇氨酸操縱子啟動子改造為組成型啟動子后增強了大腸桿 菌的蘇氨酸生產(chǎn)能力；EP1179597A1報道了通過增加轉(zhuǎn)氨酶和磯酸帰醇式丙麗酸駿化酶的 酶活，增強了蘇氨酸的合成能力；CN1323171C報道了在大腸桿菌中增強來源于谷氨酸棒桿 菌的丙麗酸駿化酶提高了改造菌株的氨基酸產(chǎn)量，該專利中也提及通過此方法可W提高蘇 氨酸產(chǎn)量。
[0005] 雖然蘇氨酸生產(chǎn)菌株產(chǎn)酸量是衡量菌株水平的一個重要指標，糖酸轉(zhuǎn)化率對氨基 酸生產(chǎn)企業(yè)來說更加重要，因為它是影響生產(chǎn)成本的更關(guān)鍵的因素，尤其是在目前能源、生 產(chǎn)原料價格日益上漲，企業(yè)在盈利空間被進一步壓縮的巨大壓力下，提升蘇氨酸生產(chǎn)菌株 的糖酸轉(zhuǎn)化率更為迫切。然而，目前本領(lǐng)域?qū)τ谌绾翁岣咛撬徂D(zhuǎn)化率的研究甚少，已有的研 究僅僅著眼于通過發(fā)酵工藝控制的優(yōu)化來達到提升糖酸轉(zhuǎn)化效率的目的，在代謝工程改造 方面的研究還比較少。
[0006] 此外，由于k蘇氨酸亦可作為其他代謝物，例如k異亮氨酸合成的前體，大腸桿 菌中異亮氨酸經(jīng)過蘇氨酸脫氨酶等走步反應(yīng)催化獲得異亮氨酸，如果能夠獲得k蘇氨酸 產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率均顯著提高的生產(chǎn)菌株，對于具有經(jīng)濟價值的其它產(chǎn)物的生產(chǎn)也都具有非常 重要的意義。
[0007] 因此，本領(lǐng)域應(yīng)當(dāng)繼續(xù)開發(fā)新的方法，不僅能夠提高蘇氨酸的產(chǎn)量，更要能夠顯著 的提高從葡萄糖到蘇氨酸的轉(zhuǎn)化效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的之一是提供一種提高k蘇氨酸轉(zhuǎn)化率的方法，或構(gòu)建轉(zhuǎn)化率提升 的k蘇氨酸產(chǎn)生菌株的方法，采用該方法可w從本身能產(chǎn)生k蘇氨酸的菌株、本身不產(chǎn)生 k蘇氨酸的菌株、或本身經(jīng)修飾而產(chǎn)生k蘇氨酸的菌株出發(fā)，構(gòu)建轉(zhuǎn)化率顯著提高的k蘇 氨酸生產(chǎn)菌株。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供利用本發(fā)明方法構(gòu)建的轉(zhuǎn)化率提升的k蘇氨酸產(chǎn)生菌 株，所述菌株在生產(chǎn)k蘇氨酸時的轉(zhuǎn)化率顯著提高。
[0010] 本發(fā)明的再一目的是提供利用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化率提升的k蘇氨酸產(chǎn)生菌株高轉(zhuǎn)化 率地產(chǎn)生k蘇氨酸的方法。
[0011] 在第一方面，本發(fā)明提供一種提高心蘇氨酸轉(zhuǎn)化率的方法，或構(gòu)建轉(zhuǎn)化率提升的 k蘇氨酸生產(chǎn)菌株的方法，所述方法包括：
[0012] a)增強適合生產(chǎn)k蘇氨酸的菌株中天冬氨酸激酶和丙麗酸駿化酶的活性。
[0013] 在優(yōu)選的實施方式中，所述天冬氨酸激酶是：
[0014] (A)具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多膚；或
[0015] 度）將SEQ ID NO:4所示氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個，優(yōu)選1-20個、更優(yōu)選1-15 個、更優(yōu)選1-10個、更優(yōu)選1-3個、最優(yōu)選1個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，具 有（A)所述多膚功能的由SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的多膚衍生的多膚；
[0016] 所述丙麗酸駿化酶是：
[0017] 似具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多膚；或
[0018] (D)將SEQ ID NO:6所示氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個，優(yōu)選1-20個、更優(yōu)選1-15 個、更優(yōu)選1-10個、更優(yōu)選1-3個、最優(yōu)選1個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，具 有（C)所述多膚功能的由SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的多膚衍生的多膚。
[0019] 在進一步優(yōu)選的實施方式中，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所 示；所述丙麗酸駿化酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0020] 在另一優(yōu)選的實施方式中，所述增強酶的活性可通過W下方法之一或組合來實 現(xiàn)；表達該酶的同源或異源的編碼基因，和/或增加所述酶的編碼基因的拷貝數(shù)，和/或 改造所述編碼基因的啟動子W增強轉(zhuǎn)錄啟動速度，和/或修改攜帶有所述編碼基因的信使 RNA的翻譯調(diào)控區(qū)W增強翻譯強度，和/或通過SD序列改造一增加所述編碼基因的轉(zhuǎn)錄強 度，和/或通過改造其調(diào)控蛋白來增加所述編碼基因的表達強度。
[0021] 在另一優(yōu)選的實施方式中，所述天冬氨酸激酶的編碼基因如SEQ ID N0:3所示；所 述丙麗酸駿化酶的編碼基因如SEQ ID NO:5所示。
[0022] 在優(yōu)選的實施方式中，所述方法在步驟a)之前還包括；將編碼天冬氨酸激酶/高 絲氨酸脫氨酶、編碼高絲氨酸激酶和編碼蘇氨酸合成酶的基因?qū)脒m合k蘇氨酸生產(chǎn)的 網(wǎng)株。
[0023] 在優(yōu)選的實施方式中，包含編碼天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氨酶、編碼高絲氨酸 激酶和編碼蘇氨酸合成酶的基因表達框的核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示；其編碼的氨基 酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0024] 在優(yōu)選的實施方式中，所述方法還包括測定所得菌株的轉(zhuǎn)化率和/或k蘇氨酸產(chǎn) 量。
[0025] 在第二方面，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)化率提升的k蘇氨酸生產(chǎn)菌株，所述菌株中的天 冬氨酸激酶和丙麗酸駿化酶的活性增強。
[0026] 在優(yōu)選的實施方式中，所述天冬氨酸激酶是：
[0027] (A)具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多膚；或
[0028] 度）將SEQ ID NO:4所示氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個，優(yōu)選1-20個、更優(yōu)選1-15 個、更優(yōu)選1-10個、更優(yōu)選1-3個、最優(yōu)選1個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，具 有（A)所述多膚功能的由SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的多膚衍生的多膚；
[0029] 所述丙麗酸駿化酶是：
[0030] 似具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多膚；或
[0031] (D)將SEQ ID NO:6所示氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個，優(yōu)選1-20個、更優(yōu)選1-15 個、更優(yōu)選1-10個、更優(yōu)選1-3個、最優(yōu)選1個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，具 有（C)所述多膚功能的由SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的多膚衍生的多膚。
[0032] 在優(yōu)選的實施方式中，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述 丙麗酸駿化酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0033] 在另一優(yōu)選的實施方式中，所述菌株為埃希氏菌屬巧scherichia)的細菌、或谷 氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutami州m);優(yōu)選大腸桿菌。
[0034] 在優(yōu)選的實施方式中，所述菌株本身具有k蘇氨酸合成能力。
[0035] 在優(yōu)選的實施方式中，所述菌株通過本發(fā)明第一方面所述的方法構(gòu)建。
[0036] 在第Η方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生k蘇氨酸的方法，所述方法包括：
[0037] 1)培養(yǎng)本發(fā)明第二方面所述的k蘇氨酸生產(chǎn)菌株，從而得到k蘇氨酸；和 [003引2)從1)的發(fā)酵培養(yǎng)體系中獲得k蘇氨酸。
[0039] 在第四方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一方面所述心蘇氨酸生產(chǎn)菌株的用途，所述菌 株用于產(chǎn)生k蘇氨酸和/或產(chǎn)生W k蘇氨酸為前體的下游產(chǎn)物。
[0040] 在優(yōu)選的實施方式中，所述W k蘇氨酸為前體的下游產(chǎn)物是k異亮氨酸。
[0041] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可W互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0042] 圖1是W天冬氨酸為前體，通過五步反應(yīng)生產(chǎn)蘇氨酸的示意圖；
[0043] 圖2是重組質(zhì)粒pwsk29-pyc-lysC的構(gòu)建過程的示意圖。
【具體實施方式】
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