一種提高大腸桿菌生產(chǎn)丁醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種提高大腸桿菌生產(chǎn)下醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 下醇是一種重要的化學(xué)品，可直接用作有機溶劑和合成多種醋類化合物的前體， 同時它也是一種比乙醇更有優(yōu)勢的生物燃料。生物下醇可由一些梭菌菌株在厭氧條件下經(jīng) 過ABE(Acetone-Bu化nol-化hanol)發(fā)酵產(chǎn)生，至今已有超過一百年的歷史。但是由于梭菌 菌株本身是嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽性細(xì)菌，遺傳操作困難，并且由于本身復(fù)雜的代謝調(diào)控機 審IJ，因此很難提升梭菌發(fā)酵生產(chǎn)下醇的能力，從而限制了生物下醇市場競爭力。借助于現(xiàn)代 生物技術(shù)，科學(xué)家開始利用易于操作的模式細(xì)菌大腸桿菌來生產(chǎn)下醇，取得了顯著的進(jìn)展。
[0003] 2008年，Shota Atsumi , James C丄iao等首先在大腸桿菌中實現(xiàn)了下醇的合成 (Atsumi S,Cann A F,Connor M R,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for 1-butanol production.Metabolic engineering,2008,10(6):305-311.),該研究組 將丙酬下醇梭菌體內(nèi)的下醇合成途徑轉(zhuǎn)移至大腸桿菌內(nèi)，致使其可產(chǎn)生少量下醇。在隨后 的幾年里，大量的相關(guān)工作逐漸開展和發(fā)表，目前報道最高的大腸桿菌下醇產(chǎn)量是14-15g/ L，接近了梭菌產(chǎn)量，但是與梭菌相比較并沒有表現(xiàn)出充分的優(yōu)勢，還遠(yuǎn)未達(dá)到有市場競爭 力的產(chǎn)業(yè)化水平，仍需要更多的改進(jìn)，比如產(chǎn)量、產(chǎn)率、底物利用等。因此還需要更進(jìn)一步的 菌株改造，提高下醇生產(chǎn)性能，運就需要尋找新的有效改造祀點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明一個目的是提供了一種構(gòu)建重組菌的方法。
[0005] 本發(fā)明提供的方法，為抑制或沉默生產(chǎn)下醇的出發(fā)菌基因組上的蘋果酸脫氨酶基 因 m化表達(dá)，得到重組菌。
[0006] 上述方法中，上述抑制或沉默生產(chǎn)下醇的出發(fā)菌基因組上的蘋果酸脫氨酶基因 m化表達(dá)為敲除生產(chǎn)下醇的出發(fā)菌基因組上的蘋果酸脫氨酶基因111化。
[0007] 上述方法中，上述敲除生產(chǎn)下醇的出發(fā)菌基因組上的蘋果酸脫氨酶基因 m化采用 入-r ed同源重組系統(tǒng)、sacB基因介導(dǎo)篩選的同源重組系統(tǒng)或CRISPR/化S系統(tǒng)。
[000引上述方法中，上述敲除生產(chǎn)下醇的出發(fā)菌基因組上的蘋果酸脫氨酶基因 m化為采 用λ-red同源重組系統(tǒng)將生產(chǎn)下醇的出發(fā)菌基因組上的蘋果酸脫氨酶基因 m化替換為兩端 帶有FRT的標(biāo)記基因。
[0009] 上述方法中，所述標(biāo)記基因為卡那霉素抗性基因；
[0010] 所述兩端帶有FRT的標(biāo)記基因片段的核巧酸序列為序列表中序列2第41-1534位。
[0011] 上述方法中，所述生產(chǎn)下醇的出發(fā)菌為大腸桿菌，所述大腸桿菌為將丙酬下醇梭 菌體內(nèi)的下醇合成途徑轉(zhuǎn)移至出發(fā)大腸桿菌得到的菌；
[0012] 所述大腸桿菌具體為邸205CGMCC No.11985;
[0013] 所述出發(fā)大腸桿菌為BW25113。
[0014] 上述方法中，所述蘋果酸脫氨酶的氨基酸序列為序列3;
[0015] 所述蘋果酸脫氨酶m化基因的核巧酸序列具體為序列1。
[0016] 上述方法中，所述將生產(chǎn)下醇的出發(fā)菌基因組上的蘋果酸脫氨酶基因 mdh替換為 兩端帶有FRT的標(biāo)記基因的方法包括如下步驟:將含有兩端帶有FRT的卡那霉素抗性基因的 同源重組DNA片段導(dǎo)入邸205(地D46)，得到重組菌；
[0017] 所述邸205(地046)為將質(zhì)粒導(dǎo)入邸205〔610：齡.11985中得到的菌；
[0018] 所述含有兩端帶有FRT的卡那霉素抗性基因的同源重組DNA片段包括m化基因上游 同源臂、上游FRT、卡那霉素抗性基因、下游FRT和m化基因下游同源臂；
[0019] 所述含有兩端帶有FRT的卡那霉素抗性基因的同源重組DNA片段的核巧酸序列具 體為序列2。
[0020] 由上述方法制備的重組菌也是本發(fā)明保護的范圍。
[0021] 上述方法或上述重組菌在生產(chǎn)下醇或提高下醇產(chǎn)量中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的 范圍。
[0022] 本發(fā)明另一個目的是提供一種生產(chǎn)下醇的方法。
[0023] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:發(fā)酵上述重組菌，得到下醇。
[0024] 大腸桿菌邸205菌已于2016年1月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中屯、(簡稱CGMCC，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究 所，郵編100101 )，保藏號為CGMCC No. 11985，分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli。
[0025] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明中可促進(jìn)大腸桿菌生產(chǎn)下醇的改造祀點為蘋果酸脫氨 酶基因（Genbank:NC_000913.3序列中的中的m化基因化3236))，通過λ-red同源重組系統(tǒng)敲 除技術(shù)，在一株產(chǎn)下醇的大腸桿菌工程菌株中敲除mdh基因，下醇產(chǎn)量可提高283%，得率可 提高89 %。
【附圖說明】
[0026] 圖1為邸205體內(nèi)的下醇生產(chǎn)途徑。
[0027] 圖2為PCR擴增含有m化基因同源片段的卡那霉素抗性基因操縱子的DNA片段。
[002引圖3為m化基因敲除突變體的PCR驗證。
[00巧]圖4為邸205AnKlh::kan發(fā)酵液使用高效液相色譜化PLC)分析的結(jié)果示意圖。
【具體實施方式】
[0030] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0031] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0032] 下述實施例大腸桿菌為將丙酬下醇梭菌體內(nèi)的下醇合成途徑轉(zhuǎn)移至BW25113得到 的菌，具體為邸205CGMCC No.11985。
[0033] 大腸桿菌邸205菌已于2016年1月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中屯、(簡稱CGMCC，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究 所，郵編100101 )，保藏號為CGMCC No. 11985，分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli。
[0034] 實施例1、敲除大腸桿菌邸205中m化基因制備重組菌
[0035] 下面的實施例用的是λ-red同源重組系統(tǒng)進(jìn)行敲除m化基因，其中設(shè)及的質(zhì)粒：
[0036] 地D4記載在如下文獻(xiàn)中：Datsenko,Kirill A. ,and BariT L.Wanner.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proceedings of the National Academy of Sciences 97.12(2000):6640-6645；
[0037] p邸46記載在如下文獻(xiàn)中：Datsenko,Kirill A. ,and BariT L.Wanner.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proceedings of the National Academy of Sciences 97.12(2000):6640-6645；
[0038] ndh基因的核巧酸序列為序列表中序列1，其編碼的蛋白蘋果酸脫氨酶的氨基酸序 列為序列表中序列3。
[0039] 1、重組菌邸205(地D46)的制備
[0040] EB205感受態(tài)細(xì)胞：在Ξ角瓶中培養(yǎng)至對數(shù)生長中期的200ml EB205菌液，冰浴 30111；[]1。4°(3,3000旨離屯、51]1；[]1。棄掉上清液，用預(yù)冷的無菌10%甘油重懸菌體，洗涂兩次。最后 加入1ml預(yù)冷的10%甘油重懸菌體，5化1每管分裝至預(yù)冷的1.5ml無菌離屯、管中備用，得到 EB205感受態(tài)細(xì)胞。
[0041 ] 邸205(地D46)重組菌：取化1 P邸46與上述邸205感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴5min，將混 合物轉(zhuǎn)移至2mm電擊杯內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，電擊轉(zhuǎn)化參數(shù)為：電壓2.化ν，25μΡ，電阻200 Ω。典型電 擊持續(xù)時間為5