一種信號(hào)肽及其在利用魔芋粉產(chǎn)l-谷氨酸重組菌中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 利用一種信號(hào)膚使重組菌高效分泌特定酶代謝廉價(jià)碳源進(jìn)行氨基酸生產(chǎn)的方法 和高效生產(chǎn)某種蛋白的方法，屬于基因工程、蛋白質(zhì)與酶工程和代謝工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 魔芋粉，主要含魔芋葡甘露聚糖，其來(lái)源是非糧食作物魔芋。據(jù)相關(guān)報(bào)道在我國(guó)云 南、貴州、四川、湖北和湖南的西部、陜西南部等地均適宜魔芋種植，目前已有一定的規(guī)模， 僅湖北省魔芋種植面積就達(dá)41萬(wàn)畝。目前魔芋粉主要用于部分食品，其水解低聚糖可作為 功能性食品，應(yīng)用還不是很廣泛。大部分微生物無(wú)法直接利用，因此，改造微生物利用魔芋 作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品具有良好的應(yīng)用前景?，F(xiàn)國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道，改造釀酒酵母 直接W淀粉為碳源生產(chǎn)乙醇，導(dǎo)入α-淀粉酶基因使谷氨酸棒狀桿菌利用可溶性生產(chǎn)k賴氨 酸的相關(guān)報(bào)道，未見有W魔芋粉底物的相關(guān)微生物改造。
[0003] 本研究室已授權(quán)的專利(公開號(hào):CN103243128A)所述并保藏的高產(chǎn)k谷氨酸的菌 種天津短桿菌SW07-1，只能W葡萄糖為主要碳源發(fā)酵生產(chǎn)k谷氨酸，不能直接利用魔芋粉 作為主要碳源。
[0004] k谷氨酸主要用于生產(chǎn)味精、香料，W及用作代鹽劑、營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑和生化試劑等。 通過(guò)基因工程和代謝工程技術(shù)進(jìn)一步改造高產(chǎn)k谷氨酸菌種，使其能利用魔芋粉作為碳源 發(fā)酵生產(chǎn)心谷氨酸。對(duì)簡(jiǎn)化心谷氨酸生產(chǎn)工藝、節(jié)約生產(chǎn)成本有一定的參考應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明通過(guò)基因工程技術(shù)將去除自身信號(hào)膚的β-甘露聚糖基因與來(lái)源谷氨酸棒 狀桿菌和枯草芽抱桿菌的Sec和化t兩個(gè)主要分泌途徑的十二條信號(hào)膚分別融合，替換對(duì)比 不同信號(hào)膚引導(dǎo)分泌0-甘露聚糖基因在不同k谷氨酸高產(chǎn)菌的效果，得到經(jīng)密碼子優(yōu)化的 0-甘露聚糖基因信號(hào)膚一一Mannase Signal化ptide(MSP)為分泌胞外酶效果較好的一種 新發(fā)現(xiàn)信號(hào)膚。
[0006] 所述MSP核巧酸序列是SEQ ID NO. 1所示的序列。
[0007] 本發(fā)明在已有高產(chǎn)k谷氨酸菌種的基礎(chǔ)上，通過(guò)基因工程技術(shù)不同信號(hào)膚引導(dǎo)分 泌β-甘露聚糖基因在構(gòu)建的不同k谷氨酸高產(chǎn)菌中表達(dá)。使其能W魔芋粉和葡萄糖作為混 合碳源進(jìn)行k谷氨酸發(fā)酵。
[000引本發(fā)明構(gòu)建的重組菌天津短桿菌SW07-1/PMS化an優(yōu)化后化發(fā)酵4她心谷氨酸的 產(chǎn)量為65±1.2g/L，發(fā)酵液中β-甘露聚糖酶的酶活為1210±4.6U/mLD(碳源添加方式:初始 lOg/L魔芋粉和30g/L葡萄糖，后期分批補(bǔ)加80g/L魔芋粉。）
[0009] 所述的技術(shù)方案：
[0010] 1.根據(jù)NCBI上公布的相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)信號(hào)膚和目的基因融合引物。
[0011] 2.重組菌的構(gòu)建
[0012]從相關(guān)菌種中抽提染色體DNA為模板，根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的引物、PCR擴(kuò)增條件和擴(kuò) 增體系進(jìn)行PCR。采用凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，瓊脂糖核酸凝膠電泳檢 驗(yàn)回收產(chǎn)物的濃度。用相同的限制性內(nèi)切酶相關(guān)表達(dá)載體和純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切， 瓊脂糖核酸凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物并用凝膠回收試劑盒對(duì)其回收，并用超微量分光光度計(jì) 檢測(cè)其濃度。將酶切后的載體和PCR產(chǎn)物按一定比例混合，在T4DNA連接酶的作用下過(guò)夜連 接。將連接產(chǎn)物用化Cl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E.coli BL21，獲得含重組質(zhì)粒的E.coli BL21。提取質(zhì) 粒，通過(guò)單雙酶切及PCR驗(yàn)證后用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入相關(guān)菌種中。最后，將含15% 甘油的重組菌液保存-70°C冰箱。
[0013] 3.重組菌的產(chǎn)酸培養(yǎng)
[0014] 將重組菌接種于新鮮的LB+0.5%Glucose液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，接種量為1%。 次日W1 %轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中（底物為可溶性淀粉和葡萄糖混合），0.8mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)， 生長(zhǎng)后期收集發(fā)酵液利用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定其氨基酸含量化-谷氨酸及相關(guān)氨基酸 等）。發(fā)酵培養(yǎng)基具備微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分，并通過(guò)相關(guān)優(yōu)化。
[0015] 4.重組菌的產(chǎn)酶培養(yǎng)
[0016] 將重組菌接種于新鮮的LB+0.5%Glucose液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，接種量為1%。 次日W1%轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中（底物為葡萄糖），〇.8mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，生長(zhǎng)后期收集發(fā)酵 液測(cè)其酶活和蛋白含量。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1:信號(hào)膚引物與β-甘露聚糖酶串聯(lián)的引物設(shè)計(jì)
[0018] 根據(jù)NCBI上公布的相關(guān)基因序列和β-甘露聚糖酶基因序列設(shè)計(jì)信號(hào)膚和基因串 聯(lián)的大片段引物。
[0019] Pl:pMSPma址indlllF
[0020] 5 '-CCCAAGCTTATGTTCAAGAAGCACACCATCTCCCTGCTGATCATCTTCCTGCTGGCT
[0021] TCCGCTGTTCTGGCTAAGCCAATCGAGGCTCATACTGTGTCGCCTGTGAATC-3 '
[0022] P2:pMSPmanBamHIR
[0023] 5 '-CGCGGATCCTTACTCAACGATTGGCGTTA-3'
[0024] 實(shí)施例2:β-甘露聚糖酶基因信號(hào)膚替換及其克隆
[00巧][1]從B.subtilis CCTCC Μ 209200提取染色體作為模板DNA。
[0026] [2]根據(jù)NCBI網(wǎng)站上公布的β-甘露聚糖酶基因序列設(shè)計(jì)信號(hào)膚和基因串聯(lián)的PCR 引物。WB.subtilis CCTCC Μ 209200的基因組為模板利用大片段引物PCR，得到帶有經(jīng)密 碼優(yōu)化的核巧酸序列如SEQ ID Ν0:1所示Mannase si即al Ρ邱tide(簡(jiǎn)稱MSP)信號(hào)膚的β-甘露聚糖酶基因。PCR擴(kuò)增體系（5化L):模板化L，上下游引物各0.扣L，dNTP Mix化L，10 X Ex Taq Buffer扣L，滅菌dd肥0 38.扣L，Ex Taq DNA聚合酶0.扣LdPCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變 性，5min，一個(gè)循環(huán)；94°C變性，30s，56°C退火，30s，72°C延伸，lmin30s，30個(gè)循環(huán)；72°C， lOmin，一個(gè)循環(huán);4°C，10min，一個(gè)循環(huán)(其中退火溫度和延伸時(shí)間根據(jù)不同引物和基因進(jìn) 行相對(duì)的調(diào)節(jié)）。采用凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，電泳檢驗(yàn)回收產(chǎn)物的濃 度?；厥债a(chǎn)物存放在1.5mL的離屯、管中，-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0027] 實(shí)施例3:重組質(zhì)粒陰MJ19-MSPman的構(gòu)建
[002引 [1]構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-MSPman，導(dǎo)入E.coliJM109。將[2]中PCR回收的產(chǎn)物與 克隆載體pMDlS-T連接，連接體系為solutionis化，目的基因4.祉L，pMD18-T質(zhì)粒0.化L，16 °0過(guò)夜連接。連接接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coilJM109,涂布于含lOOug/mL氨節(jié)青霉素的LB平板，經(jīng)37 °0培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落到含lOOug/mL氨節(jié)青霉素的lOmL液體LB培養(yǎng)基中，37°C搖床過(guò)夜 培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，命名為pMD18-T-MSPman，經(jīng)PCR和酶切驗(yàn)證連接成功后，將菌液加入甘油 于-70°C冰箱保藏。
[0029] [2]將[1]中提取的pMD18-T-MS^an質(zhì)粒與表達(dá)載體PXMJ