一種草莓果肉細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及細(xì)胞調(diào)亡檢測(cè)領(lǐng)域，具體而言，設(shè)及一種草替果肉細(xì)胞調(diào)亡的檢測(cè)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞調(diào)亡(apoptosis)是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因巧制的細(xì)胞自主的有序的 死亡，最早是1972年由Kerr教授根據(jù)形態(tài)學(xué)特征首先提出的。細(xì)胞調(diào)亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì) 胞調(diào)亡不是一件被動(dòng)的過(guò)程，而是主動(dòng)過(guò)程，它設(shè)及一系列基因的激活、表達(dá)W及調(diào)控等作 用。它并不是病理?xiàng)l件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的 一種死亡過(guò)程。細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡時(shí)，就像樹(shù)葉或花的自然調(diào)落一樣，該過(guò)程普遍存在于動(dòng)物和 植物中。
[0003] 細(xì)胞調(diào)亡是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡的方法層出不窮。目前，用于 體外細(xì)胞調(diào)亡檢測(cè)的方法已相對(duì)成熟，比如:流式細(xì)胞術(shù)、TUr^L檢測(cè)法、DNA片斷檢測(cè)等。而 用于體內(nèi)細(xì)胞調(diào)亡檢測(cè)的試劑則正在研究之中，各種檢測(cè)試劑不斷出現(xiàn)。其中，Annexin V、 Synap-to1:agmin I-C2A、ApoSense家族分子與其他檢測(cè)試劑相比具有一定的優(yōu)勢(shì)。
[0004] 植物原生質(zhì)體是細(xì)胞去除細(xì)胞壁后獲得的"裸露細(xì)胞"。自1960年英國(guó)植物生理學(xué) 家Cocking首次采用酶解法從番茄根尖分離出有活力的原生質(zhì)體W來(lái)，至今已有數(shù)百種植 物W不同組織器官為材料成功獲得了原生質(zhì)體。原生質(zhì)體可W高效攝入外源DNA、RNA、蛋白 質(zhì)等大分子。通過(guò)向原生質(zhì)體中導(dǎo)入GUS、GFP等報(bào)告基因，可從陜速準(zhǔn)確地進(jìn)行啟動(dòng)子活性 分析、蛋白質(zhì)及細(xì)胞器定位等研究。
[0005] 草替是菩薇科草替屬多年生常綠草本植物，其漿果芳香多汁，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受生產(chǎn) 者和消費(fèi)者青睞，在世界各種漿果中其栽培面積和產(chǎn)量居第2位。因此，研究草替果肉細(xì)胞 調(diào)亡過(guò)程，對(duì)商品草替培育，運(yùn)輸保存等方面有重要意義。
[0006] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種草替果肉細(xì)胞調(diào)亡的檢測(cè)方法，該方法將草替處理制 得原生質(zhì)體，選用特定的巧光探針進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的草替觀察細(xì)胞的調(diào)亡 狀況，對(duì)商品草替培育、運(yùn)輸、保存等方面有重要意義。
[000引為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用W下技術(shù)方案：
[0009] -種草替果肉細(xì)胞調(diào)亡的檢測(cè)方法，包括W下步驟：
[0010] (a)、取草替果實(shí)的果肉，切成l-2mm細(xì)條后進(jìn)行酶解處理，酶解后的混合液過(guò)濾， 得到濾液；
[0011] 化）、將所述濾液離屯、，得到的沉淀用緩沖液沖洗后得到草替原生質(zhì)體；
[0012] (C)、在草替原生質(zhì)體中加入巧光探針，35-38°C溫浴3-化，然后置于巧光顯微鏡紫 外激發(fā)光下觀察細(xì)胞調(diào)亡狀況；
[0013] 所述巧光探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0014]
[0015] 細(xì)胞調(diào)亡是機(jī)體正常細(xì)胞在受到生理和病理性刺激后出現(xiàn)的一種自發(fā)的死亡過(guò) 程，是一個(gè)主動(dòng)、高度有序、基因控制及一系列酶參與的過(guò)程。細(xì)胞調(diào)亡在植物健康生存過(guò) 程中扮演著關(guān)鍵角色，對(duì)個(gè)體的正常發(fā)育具有重要作用。它在組織分化、器官發(fā)育、機(jī)體穩(wěn) 態(tài)的維持中有著重要的意義。機(jī)體在產(chǎn)生新生細(xì)胞的同時(shí)，衰老和突變的細(xì)胞通過(guò)調(diào)亡機(jī) 制而被清除，使器官和組織得W正常地發(fā)育和代謝。
[0016] 本發(fā)明提供的草替果肉細(xì)胞調(diào)亡的檢測(cè)方法，將草替果肉切條后進(jìn)行酶解，然后 對(duì)過(guò)濾得到的濾液離屯、，離屯、的沉淀沖洗得到草替原生質(zhì)體;在草替原生質(zhì)體中加入特定 的巧光探針，經(jīng)特定時(shí)間的溫浴，在巧光顯微鏡下即可觀察草替果肉的細(xì)胞調(diào)亡狀況，整個(gè) 過(guò)程方便易行。另外，通過(guò)對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的草替觀察細(xì)胞的調(diào)亡狀況，了解草替果肉細(xì)胞 衰老的過(guò)程，為探究果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理奠定基礎(chǔ)，對(duì)商品草替培育、運(yùn)輸、保存等方面有重 要意義。
[0017] 優(yōu)選地，將草替果肉細(xì)條浸入酶解液，然后于23-27°C搖床上酶解50-60min;
[0018] 其中，所述酶解液W水為溶劑，其成分如下：纖維素酶0.005-0.015g/ml，離析酶 0.001-0.005g/ml，D-甘露糖醇3.5-4.5mol/L，氯化鐘0.01-0.03mol/L，氯化巧0.005-0.015mo 1 /L，MES緩沖液占所述酶解液的體積百分比為9 % -12 %，BSA占所述酶解液的體積 百分比為1.5%-2.5%。
[0019] 通過(guò)選用特定的酶解液，W利于對(duì)草替組織進(jìn)行充分的酶解，得到盡量多的原生 質(zhì)體。
[0020] 優(yōu)選地，在步驟(a)中，草替果肉細(xì)條浸入酶解液后先抽真空25-30min，抽真空所 用的功率為2400-2500邸a。
[0021] 先對(duì)草替果肉細(xì)條浸入酶解液后先進(jìn)行抽真空處理，W利于讓組織充分浸入酶 液，抽真空選用特定的功率，防止破壞草替細(xì)胞。
[0022] 優(yōu)選地，在步驟(a)中，所述過(guò)濾采用580-600目的尼龍網(wǎng)進(jìn)行；
[0023] 過(guò)濾的過(guò)程在冰上進(jìn)行。
[0024] 尼龍網(wǎng)過(guò)濾一方面去除未酶解徹底的組織或細(xì)胞團(tuán)，一方面將酶解得到的原生質(zhì) 體分離開(kāi)來(lái)。為了防止原生質(zhì)體受到損傷，過(guò)濾過(guò)程在冰上進(jìn)行。
[00巧]優(yōu)選地，在步驟(b)中，離屯、的轉(zhuǎn)速為195-200g，離屯、的時(shí)間為100-150S。通過(guò)低速 短暫的離屯、，W富集原生質(zhì)體，并且盡量減少對(duì)原生質(zhì)體的損害。
[0026]優(yōu)選地，在步驟（b)中，所述緩沖液W水為溶劑，其成分如下：氯化鋼0.15- ο. 16mol/L，氯化巧ο. 12-0.13mol/L，氯化鐘ο. 004-0.006mol/L，MES緩沖液占所述緩沖液的 體積百分比為0.5%-1.5% ;
[0027]所述沖洗的次數(shù)為2-3次。
[00%]通過(guò)選用特定的緩沖液對(duì)離屯、得到的原生質(zhì)體進(jìn)行沖洗，防止對(duì)原生質(zhì)體造成損 傷，沖洗后原生質(zhì)體含雜質(zhì)更少，易于后續(xù)的巧光染色，進(jìn)行巧光顯微鏡下觀察時(shí)，視野更 潔凈。
[0029] 進(jìn)一步地，在步驟(C)中，巧光顯微鏡的波長(zhǎng)為349-352nm。該波長(zhǎng)為紫外激發(fā)光下 觀察細(xì)胞調(diào)亡情況，在激發(fā)光下呈藍(lán)色的細(xì)胞為調(diào)亡狀態(tài)，呈綠色的細(xì)胞則為有活性的細(xì) 胞。
[0030] 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，草替的中部果肉制備游離的原生質(zhì)體效果更好。優(yōu)選地，在步驟(a)中， 草替果實(shí)的果肉取自果實(shí)的中部果肉。
[0031] 優(yōu)選地，在步驟（C)中，所述巧光探針在草替原生質(zhì)體中的終濃度為0.18-0.2化 mol/L。通過(guò)添加特定含量的巧光探針，W使得不同活性的細(xì)胞更好的標(biāo)記，觀察效果更直 觀和準(zhǔn)確。
[0032] 進(jìn)一步地，在步驟(b)和步驟(C)之間還包括:將草替原生質(zhì)體進(jìn)行活力檢測(cè)；
[0033] 所述活力檢測(cè)采用巧光素雙醋酸醋進(jìn)行。
[0034] 先對(duì)制得的原生質(zhì)體進(jìn)行活力檢測(cè)，W判斷制得的原生質(zhì)體存在活性，W判斷是 否進(jìn)入下一步的操作。若檢測(cè)有活力，則進(jìn)行巧光探針標(biāo)記，觀察細(xì)胞調(diào)亡的情況;若檢測(cè) 無(wú)活力，則不必再進(jìn)行下一步的操作。通過(guò)運(yùn)種預(yù)判斷，節(jié)約程序。
[0035] 進(jìn)一步地，采用巧光素雙醋酸醋進(jìn)行活力檢測(cè)具體步驟為：
[0036] 取原生質(zhì)體懸浮液200±扣1，加入10±化1質(zhì)量濃度為0.01%二乙酸巧光素，靜置 3-5min后，吸取原生質(zhì)體混合液滴在血球計(jì)數(shù)板上，于波長(zhǎng)為487-489nm顯微鏡下觀察。
[0037] 通過(guò)活力檢測(cè)，只能觀察到細(xì)胞是否存在活性，并不能觀察到細(xì)胞調(diào)亡的狀況，而 采用特定的巧光探針進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)巧光顏色的不同，能區(qū)分處在不同發(fā)育階段草替果實(shí) 細(xì)胞調(diào)亡的狀態(tài)。
[0038] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0039] (1)本發(fā)明首次提供檢測(cè)草替果肉細(xì)胞細(xì)胞調(diào)亡的方法，對(duì)制得的原生質(zhì)體選用 特定的巧光探針檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡狀況，此方法操作簡(jiǎn)便，能夠直觀的觀察草替果肉細(xì)胞調(diào)亡 的過(guò)程，為探究果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理奠定基礎(chǔ)，對(duì)商品草替培育、運(yùn)輸、保存等方面有重要意 義；
[0040] (2)本發(fā)明還對(duì)分離草替果肉原生質(zhì)體的酶液組合、酶解時(shí)間、滲透壓調(diào)節(jié)劑等因 素進(jìn)行優(yōu)化，W得到更好的原生質(zhì)體，為進(jìn)行細(xì)胞調(diào)亡檢測(cè)提供基礎(chǔ)；
[0041] (3)本發(fā)明在進(jìn)行細(xì)胞調(diào)亡前，還對(duì)草替原生質(zhì)體進(jìn)行活力檢測(cè)，通過(guò)運(yùn)種預(yù)判 斷，節(jié)約程序。
【附圖說(shuō)明】
[0042] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，W下將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0043] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制得的草替果肉綠果時(shí)期的原生質(zhì)體顯微鏡(40倍)觀察圖；
[0044] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制得的草替白果時(shí)期的原生質(zhì)體顯微鏡(40倍)觀察圖；
[0045] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例1制得的草替果肉綠果時(shí)期的原生質(zhì)體活力檢測(cè)的顯微鏡(40 倍)觀察圖；
[0046] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例1制得的草替白果時(shí)期的原生質(zhì)體活力檢測(cè)的顯微鏡(40倍） 觀察圖；
[0047] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例1制得的草替果肉綠果時(shí)期細(xì)胞調(diào)亡檢測(cè)的顯微鏡(40倍)觀 察圖；
[0048] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例1制得的草替白果時(shí)期細(xì)胞調(diào)亡檢測(cè)的顯微鏡(40倍)觀察圖；
[0049] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例1制得的另一個(gè)視野的草替白果時(shí)期細(xì)胞調(diào)亡檢測(cè)的顯微鏡 (40倍)觀察圖。
【具體實(shí)施方式】
[0050] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可W通過(guò)市售獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0化1]實(shí)施例1
[0052] 草替果肉細(xì)胞調(diào)亡的檢測(cè)方法，包括W下步驟：
[0053] (1)、配置酶解液和緩沖液，酶解液W水為溶劑，其成分如下:纖維素酶0.0 lg/ml， 離析酶0.002g/ml，D-甘露糖醇4mol/L，氯化鐘0.02mol/L，氯化巧0.01mol/L，MES緩沖液占 酶解液的體積百分比為10%，BSA占酶解液的體積百分比為2% ;
[0054] 緩沖液W水為溶劑，其成分如下：氯化鋼0.155mol/L，氯化巧0.125mol/L，氯化鐘 0.005mol/L，MES緩沖液占緩沖液的體積百分比為1% ;
[0055] (2)、分別選取處于綠果時(shí)期和白果時(shí)期發(fā)育階段的草替果實(shí)，分別取果實(shí)中部果