肝癌基因檢測方法、檢測試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域，特別是涉及肝癌相關(guān)基因的檢測試劑盒，該試劑盒在 肝癌診斷中的應(yīng)用，W及使用該試劑盒進(jìn)行肝癌相關(guān)基因檢測的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝癌嚴(yán)重威脅著我國人民的生命健康。肝癌的診斷，尤其早期診斷是臨床診療和 預(yù)后的關(guān)鍵。肝癌的治療在過去20年來已取得很大的進(jìn)展，外科手術(shù)切除及肝臟移植屬于 "根治性"治療，仍是肝癌治療的首要選擇。隨著肝癌早期診斷水平的提高及腫瘤治療生物 學(xué)概念的改變，腫瘤局部非手術(shù)治療在肝癌治療中的地位日益提高。經(jīng)導(dǎo)管動脈內(nèi)化療栓 塞（TAC巧已成為不能切除肝癌治療的首選方法，是中晚期肝癌治療的重要手段。但目前肝 癌的化療藥物基本沿用其他腫瘤的治療藥物，針對性差，療效不佳，而死亡的原因主要與其 高度轉(zhuǎn)移特性有關(guān)，常常侵犯肝內(nèi)血管而后全身轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致患者死亡。但導(dǎo)致肝癌轉(zhuǎn)移的 分子機(jī)制不清楚，尤其決定腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的內(nèi)在變異基因尚沒有確定。而確定關(guān)鍵突變基 因?qū)榛颊叩脑\斷、分型和祀向治療奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
[0003] 經(jīng)數(shù)十年的腫瘤研究表明，腫瘤是遺傳性疾病，是基因疾病，是基因組不穩(wěn)定性疾 病。尤其基因組的結(jié)構(gòu)異常，比如體細(xì)胞基因的蛋白編碼區(qū)突變（包括單堿基突變、插入和 缺失、易位等）是腫瘤形成的重要機(jī)制之一。送些體細(xì)胞的基因突變既能引起癌基因的活 性增強(qiáng)，比如MYC和RAS基因等；也能夠使抑癌基因的活性喪失，比如TP53和APC等。一般 認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生是一個(gè)包含多種遺傳學(xué)損傷的多步驟過程。送種損傷可W導(dǎo)致細(xì)胞逃避 正常的生長控制，也可W激活某種生存機(jī)制的通路。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤形成至少需要4-5步的 遺傳學(xué)突變，突變基因涉及約12類信號通路的失調(diào)。眾多的證據(jù)表明，不同的基因突變與 患者臨床特征、預(yù)后、治療反應(yīng)甚至治療方法密切相關(guān)，比如EGFR和B-RAF發(fā)生突變，可W 選擇相應(yīng)的抑制劑進(jìn)行祀向治療，獲得成功。目前，技術(shù)的飛速發(fā)展給我們深入研究腫瘤帶 來了新的機(jī)遇，送些技術(shù)可W讓我們從全基因組的水平全面理解腫瘤的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī) 巧[|，可W更準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)更多的腫瘤致病基因，尤其突變基因，將為腫瘤診斷指標(biāo)、分子分型 W及藥物祀標(biāo)的發(fā)現(xiàn)等奠定了很好的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種肝癌基因檢測試劑盒，它可W準(zhǔn)確、快 速地捕獲肝癌關(guān)聯(lián)基因。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的肝癌基因檢測試劑盒，包括與94個(gè)肝癌關(guān)聯(lián)基因 的外顯子區(qū)域和TERT基因的3個(gè)啟動子區(qū)域相匹配的97個(gè)祀向探針。
[0006] 所述的肝癌關(guān)聯(lián)基因?yàn)橥蛔冾l率在4% W上、相同基因在3個(gè)W上不同群體出現(xiàn) 且小于等于 1〇化的基因。包括；ADAMT化3、ADCY2、AMPH、APC、AR、ARID1A、ARID1B、ARID2、 ATAD3B、ATM、AXIN1、AXIN2、BAZ2B、BRAF、BRCA2、B畑8、B畑9、BRE、C180RF34、CACNA1C、 CACNA2D4、CCNE1、CD冊、CDKN2A、CLIP1、C0L11A1、C0L5A3、CPA2、CSMD3、CTNNB1、DCAF化2、 DISCI、D0CK7、DSE、ELMOl、EPS15、邸RFIl、FAM5C、GJAl、GNAS、GPR126、GX化τι、HDAC9、 HIST1H4B、IGFIR、IGSFIO、IGSF3、IRF2、ITPR2、JAK1、KEAP1、KRAS、LIPI、LRP1B、MLL3、MLL4、 MXRA5、N 陽化 2、OTOP1、PAM、PCDHl 5、PCDHA13、PCDHA7、PCMTD1、PDZRN4、PEG3、PIK3CA、PREX2、 PROKR2、PTEN、RAD IL、RNF43、R0B02、ROCK 1、RPS6KA3、SAMD化、SCN3A、SCN8A、沈NP5、化C1OA1、 SMAD4、SOS1、SPAG17、SYNJ2、TERT、TMEM170A、TMEM51、TP5 3、TT化2、UBR3、USP2 5、WWP1、ZIC3、 ZNF226〇
[0007] 所述的 TERT 基因的啟動子區(qū)域?yàn)?c虹5 :1253287-1253843,1295104-1295162, 1295162-1300162。
[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供上述試劑盒在肝癌診斷中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之Η是提供使用上述試劑盒檢測肝癌基因的方法，其步 驟包括：
[0010] 1)采集患者的肝臟組織樣本，進(jìn)行樣本DNA抽提、純化、質(zhì)檢；
[0011] 2)對樣本DNA進(jìn)行酶切、雜交、捕獲、連接、洗脫、擴(kuò)增，構(gòu)建測序樣本文庫；捕獲采 用權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的試劑盒；
[0012] 3)檢測樣本文庫的濃度、大小和純度；
[0013] 4)測序，數(shù)據(jù)分析，確定發(fā)生突變的基因及突變頻率。
[0014] 步驟4)中的數(shù)據(jù)分析包括；測序結(jié)果mapping、單樣本SNV分析、單樣本Small InDel分析、樣本間SNV差異分析、樣本間Small InDel差異分析。
[0015] 較佳的，在步驟4)的數(shù)據(jù)分析之后，還可W對數(shù)據(jù)分析結(jié)果進(jìn)行二次抽取分析， 對該肝癌病人的肝癌組織和癌旁組織存在的亞克隆群體進(jìn)行分類及病理分級。分類及病理 分級的方法是：將每個(gè)樣本參加測序的基因組總量與100個(gè)細(xì)胞的預(yù)測基因組量A比較，推 巧Ij 100個(gè)細(xì)胞應(yīng)有的測序數(shù)據(jù)量a ;從總的測序數(shù)據(jù)中隨機(jī)抽取10次a,將該10次抽調(diào)出 來的數(shù)據(jù)a做相關(guān)性分析，再將最終得到的突變基因突變頻率做聚類分析，得出組織中可 能存在的克隆群體及其所占比例。
[0016] 本發(fā)明針對肝癌相關(guān)基因開發(fā)用于祀向捕獲基因測序的試劑盒，并將其應(yīng)用在肝 癌的診斷上，使肝癌的臨床診斷更加準(zhǔn)確、快速，從而有助于臨床醫(yī)生更好地選擇肝癌的個(gè) 性化治療方案。
【附圖說明】
[0017] 圖1是本發(fā)明的肝癌基因檢測試劑盒的設(shè)計(jì)及應(yīng)用流程圖。
[001引圖2~圖5是本發(fā)明實(shí)施例1的測序樣本文庫的濃度及片段大小的質(zhì)控結(jié)果。
[0019] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例1的樣本富集統(tǒng)計(jì)圖，覆蓋深度都在5000倍W上。
【具體實(shí)施方式】
[0020] W下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，即Agilent公司和Illumina公司指定的操作流程和 條件。
[0021] 實(shí)施例1兩例肝癌病人的祀向捕獲測序
[0022] 測序方法包括W下步驟：
[0023] 1.采集兩例肝癌手術(shù)病人的癌旁組織和癌組織共4個(gè)組織樣本ΤΙ、PI、Τ2、P2燈 代表癌組織，P代表癌旁正常組織，-8(TC冰箱保存，樣本來源于南京市江蘇省人民醫(yī)院肝膽 外科），進(jìn)行組織DNA抽提。本實(shí)驗(yàn)采用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen，69506)試劑 盒，并且根據(jù)生產(chǎn)廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，進(jìn)行樣本的DM抽提及純化。DM經(jīng)Nano化op? ND-1000分光光度計(jì)和0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢合格后備用，DM質(zhì)檢結(jié)果見表1。
[0024] 表1兩對樣本燈1/PUT2/P2)中抽提DNA后的質(zhì)量評價(jià)結(jié)果
[00 巧]
[002引 2.按照 Agilent 公司 HaloPlex Target Enrichment System for IIlumina 化ired-End Sequencing Library對基因組DNA進(jìn)行酶切、雜交、捕獲、連接、洗脫、擴(kuò)增等步 驟，完成測序樣本文庫構(gòu)建。
[0027] 肝癌關(guān)聯(lián)候選基因的篩選方法如下：
[0028] 第一步，整合現(xiàn)有針對肝細(xì)胞癌病例樣本測序的文獻(xiàn)和報(bào)道，對每篇文獻(xiàn)中提及 的體細(xì)胞突變基因進(jìn)行整合；
[0029] 第二步，歸總，將各個(gè)文獻(xiàn)中整合出的優(yōu)先篩選基因整合到一起，分別將基因的突 變頻數(shù)和樣本數(shù)疊加后統(tǒng)計(jì)突變頻率，再刪除重復(fù)基因，將送批基因作為優(yōu)先候選基因；
[0030] 第Η步，將對各個(gè)文獻(xiàn)中單獨(dú)整合的其他基因序列進(jìn)行再次整合。首先對送些基 因的突變頻數(shù)進(jìn)行重新統(tǒng)計(jì)，方法同第二步，額外添加兩個(gè)篩選條件：1、同一基因出現(xiàn)在Η 個(gè)W上樣本群體中，即有Η個(gè)W上不同研究小組都檢測到該突變基因；2、在第1個(gè)