用于檢測il28b基因多態(tài)性的探針、基因芯片和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的設(shè)及用于IL28B基因多態(tài)性檢測的探針、基因忍 片和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒化epatitis C virusJCV)引起的一種傳染 病。HCV感染是引起全球慢性肝病的主要原因之一，我國HCV感染率約為3.2%，每年新發(fā)丙 肝病例約3.5萬例。目前，丙型肝炎尚無有效疫苗預(yù)防感染。
[0003] 人IL28B基因位于染色體19ql3.13的AC011445.6基因群上，屬于ΙΠ 型干擾素家 族，編碼ΙΡΝ-λ3。IL28B基因由6個外顯子和5個內(nèi)顯子組成，含有由
[0004] 22個氨基酸組成的信號膚。研究發(fā)現(xiàn)丙型肝炎的治療與宿主的IL28B基因多態(tài)性 高度相關(guān)。IL28B基因的兩個多態(tài)性位點rsl2979860和rs8099917與丙型肝炎病毒患者的病 毒清除有顯著的相關(guān)性，即與丙肝患者標(biāo)準(zhǔn)化治療方案(聚乙二醇干擾素聯(lián)合利己韋林)的 抗病毒治療效果密切相關(guān)。
[0005] 隨著IL28B基因多態(tài)性臨床診斷價值的出現(xiàn)，市場上有各種檢測試劑盒誕生。如基 因測序、高分辨率溶解曲線法化igh-resolution melting analysis，HRM)、雜交探針法 化ybridization p;robe，HP)、TaqMan探針法、PCR等。其中，基因測序法操作繁瑣，工作量大 成本高;HRM法操作繁瑣，需用測序法對所得結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)且必須用特殊的儀器設(shè)備;HP 法成本較高；TaqMan探針法成本高，結(jié)果受化q酶活性影響較大，只能用于少量SNP位點分 析，需要特殊的儀器設(shè)備，不能發(fā)現(xiàn)未知SNP位點;PCR每次只能檢測一種突變要多管體系相 對應(yīng)，存在操作不便的缺點。
[0006] 本發(fā)明采用的基因忍片進(jìn)行檢測，其檢測通量大，在一張忍片上一次性完成兩個 位點多態(tài)性的檢測，結(jié)果更準(zhǔn)確，具有檢測靈敏度高、特異性好，所需樣本量少等優(yōu)點。傳統(tǒng) 的基因忍片技術(shù)的檢測，是基于巧光標(biāo)記探針的巧光發(fā)光來進(jìn)行檢測的。其信號弱，必須經(jīng) 過激發(fā)，才能發(fā)光，需要昂貴的激光掃描設(shè)備。在臨床檢測應(yīng)用過程中，由于檢測單位需要 投資購置激光掃描設(shè)備，一方面，顯著增加了進(jìn)行相關(guān)檢測的投資成本，另一方面，也直接 增加了應(yīng)用成本，限制了該技術(shù)的市場應(yīng)用與推廣。本發(fā)明可通過生物忍片的可見光光學(xué) 放大，做到了信號分辨率高，信號可W用普通數(shù)碼相機(jī)拍照或肉眼直接判讀。相對傳統(tǒng)巧光 標(biāo)記具有良好的效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種快速準(zhǔn)確、結(jié)果直觀的IL28B基 因多態(tài)性檢測的基因忍片和試劑盒。
[000引為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0009] -組用于IL28B基因多態(tài)性檢測的探針，包括rsl2979860和rs8099917位點的探 針;所述探針序列為：
[0010] rsl2979860-C 探針：TATTTGTTGGGGTAATCAACTGTT;
[0011] rsl2979860-T 探針：TATTTGCTGGGGAAACCACTTGTT;
[0012] rs8099917-T探針：CATTTGTTGGGGTAACCAACTATT;
[0013] rs8099917-G 探針：TGTTTGCTGGCATAATCAATTATT。
[0014] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的內(nèi)容還包括用于IL28B基因多態(tài)性檢測的基因忍片，其特征在 于，所述基因忍片包括固體相和權(quán)利要求1所述探針。
[0015] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的內(nèi)容還包括用于IL28B基因多態(tài)性檢測的基因忍片試劑盒，其 特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述探針或權(quán)利要求2所述基因忍片。
[0016] 進(jìn)一步地，所述基因忍片試劑盒還包括W下引物對：
[0017] rsl2979860 引物對：
[001 引上游通用引物FP1:5 ' -CGCGATGCCCCGGGCCACG-3 ' ；
[0019]下游通用引物RPl:5'-Bio GGTCACCGCCCAGCCCCTGTG-3'；
[0020] rs8099917 引物對：
[0021] 上游通用引物FP2:5 ' -CACCATCCTCCTCTCATCCCTC-3 ' ；
[0022] 下游通用引物RP2:5'-Bio GCCAGCTACCAAACTGTATAC-3'。
[0023] 進(jìn)一步地，所述引物上含有有生物素標(biāo)記。
[0024] 進(jìn)一步地，所述基因忍片試劑盒還包括PCR反應(yīng)體系、陰性對照品、陽性對照品、雜 交緩沖液、洗涂液、BW反應(yīng)液和TMB顯色液。
[0025] 進(jìn)一步地，所述陽性對照品為9860-Τ，9917-Τ型樣本濃度106-10 9copies/ml，所述 陰性對照品為生理鹽水。
[00%]進(jìn)一步地，所述雜交緩沖液為巧樣酸Ξ鋼0.3M、氯化鋼3M、十二烷基硫酸鋼0.3M、 Triton X-1000.1 %水溶液。
[0027]進(jìn)一步地，所述洗涂液分為洗涂液A和洗涂液B，所述洗涂液A為0.01-0.1N化0H溶 液，所述洗涂液B為0.1 X SSC溶液。
[002引進(jìn)一步地，所述BW反應(yīng)液為用20 X SSC緩沖液將HRP標(biāo)記的親合素稀釋到1:5000~ 1:10000。
[0029] 為了更好地理解和實施，下面詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0030] 本發(fā)明通過特異性的引物和探針的選擇，結(jié)合基因忍片技術(shù)，不僅提高了檢測效 率和準(zhǔn)確度。
[0031] 本發(fā)明通過PCR技術(shù)對病原體DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與生物忍片上的寡核巧酸探 針進(jìn)行雜交，通過通過生物素標(biāo)記，顯色液進(jìn)行顯色后，直觀的表現(xiàn)檢測結(jié)果。
[0032] 本發(fā)明的基因忍片試劑盒，通過生物忍片的可見光光學(xué)放大，做到了信號分辨率 高，信號可W用普通數(shù)碼相機(jī)拍照或肉眼直接判讀。相對傳統(tǒng)巧光標(biāo)記具有良好的效果。為 了更好地理解和實施，下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明。
【附圖說明】
[0033] 圖1是本發(fā)明采用基因忍片對人工合成的核酸鏈對應(yīng)包含有待檢測的特異性基因 序列的9860CC質(zhì)粒，9860TT質(zhì)粒，9917TT質(zhì)粒，9917GG質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增和檢測結(jié)果。
[0034] 圖2A、B、C、D、E分別對不同濃度9860CC質(zhì)粒擴(kuò)增和陰性樣品雜交檢測結(jié)果。
[00巧]圖3A、B、C、D、E分別對不同濃度9860TT質(zhì)粒擴(kuò)增和陰性樣品雜交檢測結(jié)果。
[0036] 圖4A、B、C、D、E分別對不同濃度9917TT質(zhì)粒擴(kuò)增和陰性樣品雜交檢測結(jié)果。
[0037] 圖5A、B、C、D、E分別對不同濃度9917GG質(zhì)粒擴(kuò)增和陰性樣品雜交檢測結(jié)果。
[003引圖6為9860CC、9860TT、9917TT和9917GG四種樣本提取DNA后雜交檢測結(jié)果。
[0039] 圖7A、B、C、D、E、F為6組基因型為9860CC的標(biāo)本提取DNA后雜交檢測結(jié)果。
[0040] 圖8A、B、C、D、E、F為6組基因型為9860TT的標(biāo)本提取DNA后雜交檢測結(jié)果。
[0041 ] 圖9A、B、C、D、E、F為6組基因型為9917TT的標(biāo)本提取DNA后雜交檢測結(jié)果。
[0042] 圖10A、B、C、D、E、F為6組基因型為9917GG的標(biāo)本提取DNA后雜交檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0043] 【實施例1】忍片和檢測試劑盒的制備
[0044] 基因忍片：按真空氣相沉淀法鍛膜，使用旋轉(zhuǎn)真空鍛膜機(jī)在厚度約為2.5mm，直徑 20cm娃片（Si〇2)上鍛上475埃的氮化娃及135埃的TSPS的薄膜，制備出相應(yīng)的生物傳感器， 并覆蓋150埃的多聚苯丙氨酸-賴氨酸涂層，最后經(jīng)過1-lOuM鹽酸班巧酸酷亞胺基煙酸鹽處 理20分鐘，清水洗凈供忍片制作。將氨基修飾的探針，按照表1排列分別將探針點樣到處理 好的忍片上，探針序列如表2所示;每組設(shè)兩個平行點樣點：室溫下反應(yīng)，制備出包含探針的 基因忍片。
[0045] 表1基因忍片探針點樣排列
[0048] 表2點樣的探針序列[0049]
[0046]
[0047]
[0050] 試劑盒:本實施例中試劑盒的組成如表3:
[0化1 ] 表3試劑盒組成
[0化2]
[0053]【實施例2】雜交反應(yīng)過程
[0化4] 本實施例中基目標(biāo)因片段rsl2979860(C/T)和rs8099917(T/G)如序列表SEQ ID N0.1和SEQ ID ^.2所示。含有目標(biāo)片段的質(zhì)粒9860(：(：質(zhì)粒，98601'1'質(zhì)粒，99171'1'質(zhì)粒， 99