一種檢測藤壺幼蟲早期附著程度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及在主要的海洋污損真核生物中對污損早期藤 壺幼蟲附著的測定。
【背景技術(shù)】
[0002] 海洋污損生物又稱海洋附著生物，是生長在船底、下水管道、石油平臺、漁業(yè)的網(wǎng) 具及一切海中人為設(shè)施表面的有害生物。其中藤壺是最主要的海洋污損之一，藤壺 (Barnacle)又稱為"馬牙"或"阿徹仔"，屬于節(jié)肢動物口（Arthropoda)、甲殼綱 (Crustacea)、圍胸目（Thoracica)、蔓足類動物，目前發(fā)現(xiàn)的藤壺共有8科約541種，其中我 國約有110種。
[0003] 藤壺W其特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生活史和種群生態(tài)成為最主要的海洋污損之一，主要 生活在潮間帶及朝下帶，附著棲息在海水中固定或浮動的硬物上，若附著在網(wǎng)箱上，不僅堵 塞網(wǎng)箱網(wǎng)衣，易造成養(yǎng)殖的環(huán)境變差，而且增大網(wǎng)箱衣阻力，易發(fā)生大潮訊期魚體擦傷;若 附著在船底，增加船舶阻力，使航速降低;若附著在浮標(biāo)上，能降低浮力。而目前有效果的防 污涂料會對海洋生態(tài)系統(tǒng)造成一定得影響，因此，針對藤壺可W試從它生長發(fā)育階段的幼 蟲附著期進(jìn)行有目標(biāo)的防除。而想要在藤壺早期附著時進(jìn)行測試其附著率，分子標(biāo)記方法 成為首選的技術(shù)手段，避開生物形態(tài)結(jié)構(gòu)差異的干擾，直接通過檢測生物體內(nèi)大分子包含 的穩(wěn)定遺傳信息，定量描述、分析附著情況，提高了早期鑒定主要海洋污損生物物種的準(zhǔn)確 度和效率。
[0004] 藤壺的附著測定至少在如下幾個方面非常重要：（1)快速比較一批防污涂層在海 洋污損早期（肉眼可見藤壺生長之前)抑制藤壺幼蟲附著能力的差異；（2)比較某個涂層在 室內(nèi)藤壺純培養(yǎng)體系中幼蟲附著率與實際海水中幼蟲附著率的差異。（3)優(yōu)質(zhì)涂層抑制海 洋污損的機(jī)制研究:有時需要測定在某個特定的涂層表面藤壺的附著生長被抑制是由于幼 蟲附著被抑制還是附著后生長被抑制。
[0005] 中國專利(CN101654704A)報道了一組引物用來區(qū)分不同藤壺的亞種分類，可W區(qū) 分白脊藤壺和紋藤壺。本專利設(shè)及的引物可W用來測定更多藤壺亞種的幼蟲附著。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種在海洋污損中對污損早期藤壺幼蟲附著的測定。測定 的特異性是由藤壺特異性引物來保障的。該特異性引物時基于藤壺的18S rDNA設(shè)計的，其 序列為AmpRl:5'-ATG CTT TCG CAG TAG TTC GTTG-3'。它與核糖體基因18S rDNA的通用引 物巧66(5'-GGC ATC ACA GAC CTG TTA TTG C-3'）一起使用可W確保藤壺基因擴(kuò)增的特異 性。擴(kuò)增結(jié)果可W通過qPCR或一般PCR結(jié)束后的凝膠掃描來實現(xiàn)定量測定。
[0007] 本發(fā)明是通過W下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
[000引一種基于分子標(biāo)記技術(shù)，在主要海洋污損真核生物中檢測藤壺幼蟲附著程度的方 法，該方法包括W下步驟：
[0009] (1)藤壺特異性引物的設(shè)計；
[0010] 間污損早期（肉眼可見附著藤壺之前)海水污損樣本的采集和基因組提?。?br>[0011] 間利用藤壺特異性引物對上述基因組樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增來測定藤壺幼蟲的附著。
[0012] 而且，藤壺特異性引物設(shè)計方法如下：比較主要海洋污損真核生物的18S核糖體基 因序列，找出來藤壺的特異性SNP(單核巧酸多態(tài)性)位點。該位點作為引物的3'最末端位置 使用。引物的3'倒數(shù)第二位的堿基設(shè)計原則是，它與祀序列之間沒有錯配或形成一個錯配 (弱錯配:A-CJ-G;或者是中等強(qiáng)度的錯配:4-4，(：-(：，6-6)，與非祀序列也形成一個錯配(強(qiáng) 錯配:T-T，T-C，A-G;或者是中等強(qiáng)度的錯配:4-4,0(：，6-6)。運樣一來，引物與祀序列完全 配對或只有一個3 '倒數(shù)第二位的錯配，一般不影響擴(kuò)增效果，而與非祀序列有兩個3 '最末 端的連續(xù)兩個錯配，一般導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。如此可W獲得藤壺特異性引物。
[0013] 而且，上述方法設(shè)計的藤壺特異性引物之一為AmpRl:5'-ATG CTT TCG CAG TAG TTC GTTG-3'。該引物與通用引物F566:5'-GGC ATC ACA GAC CTG TTA TTGC-3'一起使用可 W完成早期污損樣品中藤壺幼蟲存在與否的測定判斷。
[0014] tL間物設(shè)計
[0015] 通過某海水污損樣本中18S rDNA的擴(kuò)增（擴(kuò)增引物為5'-AAC CTG GTT GAT CCT GCC AGT-3'和5'-GAT CCT TCT GCA GGT TCA CCT AC-3'）及克隆測序，獲得一批有效克隆， 之后進(jìn)行BLAST生物信息學(xué)分析，確認(rèn)一批污損真核生物(含藤壺）的各自的18S序列。很多 18S序列也可W通過數(shù)據(jù)庫下載整理得到。通過對上述18S序列的多序列比對和反復(fù)比較， 找出來藤壺的若干個特征性SNP(單核巧酸多態(tài)性)位點多個。W運些SNP位點作為引物的3' 最末端位置嘗試設(shè)計引物。引物的3'倒數(shù)第二位的堿基設(shè)計原則是，它與祀序列之間形成 一個錯配，與非祀序列也形成一個錯配。運樣一來，引物與祀序列只有一個3'倒數(shù)第二位的 錯配，而與非祀序列有兩個3'最末端的連續(xù)兩個錯配。擴(kuò)增長度在100-500堿基W便于用于 qPCR(也可W用于一般PCR)。運些引物對經(jīng)過合成后W藤壺18S序列的克隆純質(zhì)粒為模板進(jìn) 行PC閲金證擴(kuò)增特異性，W及qPC閲金證(要求只擴(kuò)增出來特異目的條帶，Tm值分析只有主帶 (不含引物二聚體），確定各對引物的特異性。選出最佳擴(kuò)增特異性的引物(對）。特異性引物 也可W與通用引物配對使用。原則上可W設(shè)計出來不止一對最佳引物。因為藤壺本身的亞 種很多，可W依據(jù)上述方法設(shè)計某個或某些特定亞種的特異性引物，也可W設(shè)計某類藤壺 區(qū)分特定其他物種（如盤管蟲）的特異性引物。最佳引物對之一為AmpRl: 5 ' -ATG CTT TCG CAG TAG TTC GTTG-3'與通用引物巧66:5'-GGC ATC ACA GAC CTG TTA TTGC-3'。使用該引 物對擴(kuò)增出來的產(chǎn)物(400左右堿基對)經(jīng)過DNA測序證明全部為藤壺18S序列。經(jīng)過分析，該 最佳引物對適用于如下藤壺種類的測定(表格1):
[0016] 表格1特異性引物適用的藤壺種類
[0017]
[001 引
[0019] 間污損早期（肉眼可見附著藤壺之前)海水污損樣本的采集和(宏)基因組提取
[0020] 適用于海上現(xiàn)場取樣或室內(nèi)純培養(yǎng)體系中的污損樣本取樣。海上早期污損樣本的 現(xiàn)場采集和宏基因組提取可采用熱酪氯仿抽提法，其具體步驟為：1)將污損樣品在海上(現(xiàn) 場)刮下來約200微升，內(nèi)含各種海洋生物及附著的藤壺幼蟲(純培養(yǎng)體系中就只有藤壺幼 蟲），添加600微升飽和酪(P冊），劇烈震蕩一分鐘。帶回實驗室。2)75度水浴震蕩10分鐘后， 室溫靜置3min，lOOOOr/min離屯、lOmin; 3)吸取上層清液至新EP管中并加入等體積酪，劇烈 震蕩Imin后1000化/min離屯、10min;4)取其上層清液再加入等體積酪氯仿（1:1)，混勻Imin 后lOOOOr/min離屯、15min;5)取上層清液再加入等體積的氯仿，混勻Imin后lOOOOr/min離屯、 15min;取上清即為樣品的(宏)基因組。
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