重組聚多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及可以篩選構(gòu)建各種長度的重組聚多肽和包含該重組聚多肽的藥物組 合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物活性大分子，一般是不穩(wěn)定的多肽或者蛋白質(zhì)，大部分半衰期都較短，為了維 持一定的療效需要大劑量頻繁給藥，長期的反復(fù)注射不僅增加了病人的痛苦而且易引發(fā)一 系列副反應(yīng)。另外，許多生物活性肽和蛋白質(zhì)只具有有限的溶解度，或者在重組生產(chǎn)過程中 易聚集，需要復(fù)雜的溶解和重折疊過程。多種化學(xué)聚合物可以連接到這些蛋白質(zhì)上以改變 其性質(zhì)。特別有意義的是具有柔性構(gòu)象并且在水溶液中良好水合的親水性聚合物。一種常 用的聚合物是聚乙二醇(PEG)，目前已用于多種蛋白質(zhì)藥物或非蛋白質(zhì)藥物的修飾，在國外 已經(jīng)上市的PEG化藥物已達(dá)11種，并且國內(nèi)外有多種PEG化藥物在研或者已經(jīng)進(jìn)入臨床。這 些聚合物常常具有依賴于它們分子量的較大的流體動(dòng)力學(xué)半徑，并且會(huì)顯著增強(qiáng)藥代動(dòng)力 學(xué)性質(zhì)。但PEG修飾蛋白質(zhì)類藥物需要額外的下游工藝和純化步驟，從而會(huì)降低產(chǎn)量、增加 成本;并且，常用的PEG化修飾位點(diǎn)是賴氨酸和蛋白質(zhì)的N-端氨基酸殘基，這種隨機(jī)性的修 飾方式會(huì)形成多種結(jié)構(gòu)，影響PEG修飾后的蛋白質(zhì)純化，這種不均一性也會(huì)影響修飾后的蛋 白質(zhì)活性，因此需要開發(fā)PEG的定點(diǎn)修飾技術(shù)；同時(shí)現(xiàn)在大量臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)反復(fù)長期給予 PEG化的藥用蛋白后，可能會(huì)形成抗PEG的抗體介導(dǎo)機(jī)體對(duì)藥用蛋白的清除；在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中 發(fā)現(xiàn)PEG還可能在組織中蓄積，嚴(yán)重時(shí)可對(duì)腎臟造成損傷。
[0003] 白蛋白和免疫球蛋白片段如Fc區(qū)也已經(jīng)用于偶聯(lián)其它生物活性蛋白質(zhì)，但在半衰 期或免疫原性提高方面具有不可預(yù)測(cè)的結(jié)果。遺憾的是，F(xiàn)c融合或者白蛋白融合都需要在 真核重組表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行。這是一個(gè)耗時(shí)的、昂貴的過程。因此，仍然非常需要能夠提高生 物活性多肽或蛋白質(zhì)安全性和藥學(xué)性質(zhì)的聚合物和方法。
[0004] 近年來研究，為了解決PEG修飾的問題，開發(fā)了模擬PEG的聚多肽融合技術(shù)。模擬 PEG的聚多肽融合技術(shù)經(jīng)過了多年的發(fā)展，從一開始的天然來源的聚多肽、明膠樣蛋白聚多 肽、彈性蛋白樣聚多肽、多聚谷氨酸、多聚甘氨酸到現(xiàn)在的最新的XTEN技術(shù)（如專利 102348715A記載）。聚多肽XTEN技術(shù)已經(jīng)可以解決原有聚多肽免疫原性高、易聚集、不能顯 著增加半衰期等問題。目前，聚多肽融合技術(shù)雖還在發(fā)展的初期，但XTEN修飾的長效rhGH已 經(jīng)進(jìn)入了臨床Phase II期，XTEN修飾的Exendin-4也進(jìn)入臨床Phase I期，我們相信聚多肽 技術(shù)將會(huì)為多肽和蛋白質(zhì)類藥物長效化提供更好的選擇?，F(xiàn)有模擬PEG的聚多肽融合技術(shù) 具有以下諸多優(yōu)點(diǎn)：1.通過基因工程技術(shù)構(gòu)建，可與藥用蛋白融合表達(dá)，避免了體外PEG化 學(xué)偶聯(lián)和修飾后的純化步驟;2.區(qū)別于PEG修飾技術(shù)融合表達(dá)的聚多肽鏈?zhǔn)峭耆缮锝?解的；3 .動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這些PEG模擬肽都是安全和低免疫原性的；4.多肽鏈有確切的 長度和氨基酸組成，可通過調(diào)節(jié)多肽鏈長度，調(diào)節(jié)融合蛋白的半衰期；5.適用范圍廣泛，原 核、真核系統(tǒng)都可以表達(dá)。與PEG修飾相比，聚多肽在下游純化、免疫原性、安全性等方面都 具有明顯的優(yōu)勢(shì)。但新型聚多肽XTEN融合技術(shù)并沒有完全模擬PEG。XTEN帶有顯著的負(fù)電荷 (Schellenberger，Volker，et al .Nature biotechnology27.12(2009): 1186-1190.)，區(qū)別 與傳統(tǒng)的PEG修飾技術(shù)，顯著負(fù)電荷存在著一些缺點(diǎn)：1.影響藥物的組織分布;2.減低與革巴 受體的親和力，降低生物活性;并且XTEN基本是由非重復(fù)基序組成，篩選過程復(fù)雜且龐大。 因此，仍然需要建立篩選過程相對(duì)簡單的模擬PEG的聚多肽分子用于提高生物活性蛋白質(zhì) 的藥用性質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明涉及能夠用于提高生物活性蛋白質(zhì)的生物學(xué)、藥學(xué)、安全性和治療性質(zhì)的 組合物和方法。該組合物和方法可用于提高藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，如半衰期，延長生物活性蛋白 質(zhì)治療窗內(nèi)停留的時(shí)間，以及簡化這種生物活性蛋白質(zhì)的生產(chǎn)過程和藥學(xué)性質(zhì)，如溶解性。
[0006] 部分上，本發(fā)明涉及包含融合蛋白的藥物組合物及其在治療疾病、障礙或病癥中 的應(yīng)用?？梢灾委煹木唧w的疾病取決于生物活性蛋白質(zhì)的選擇。
[0007] 本發(fā)明提供聚多肽的組合物，當(dāng)重組聚多肽連接到生物活性蛋白質(zhì)時(shí)提高藥代動(dòng) 力學(xué)性質(zhì)，和/或治療活性。這樣的組合物可以用于治療某些疾病、障礙或病癥。得到的融合 蛋白可以表現(xiàn)出更好的安全性性質(zhì)，并且允許頻率較低的給藥，這又導(dǎo)致了更好的患者依 從性。本發(fā)明也提供了編碼聚多肽與聚多肽連接的生物活性蛋白質(zhì)的融合蛋白的多聚核苷 酸序列。
[0008] 本發(fā)明提供分離的聚多肽，其包含超過大約100至大約5000個(gè)氨基酸殘基，其中該 聚多肽的特征在于甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、脯氨酸(P)和賴氨酸(K) 六種氨基酸殘基的總和占聚多肽總氨基酸序列的超過大約95%以上;聚多肽序列是可重復(fù) 的;通過G0R算法確定，該聚多肽序列至少具有95 %的無規(guī)則卷曲形成;通過Chou-Fasman算 法確定，該聚多肽序列具有α螺旋和β折疊的總和小于2%。
[0009] 作為優(yōu)化方案，本發(fā)明提供包含超過大約100至大約5000個(gè)氨基酸殘基的聚多肽， 其中該聚多肽的特征在于由短序列組成，重復(fù)的短序列可以占到總序列大約30%以上，其 中每個(gè)短序列具有大約8至24個(gè)氨基酸殘基，其中任意一種氨基酸在序列中都不會(huì)連續(xù)出 現(xiàn)，該序列由甘氨酸(G)、丙氨酸(Α)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(Τ)、脯氨酸(Ρ)和賴氨酸(Κ)中的3-6種類型的氨基酸組成。該聚多肽當(dāng)連接到生物活性蛋白質(zhì)時(shí)增強(qiáng)生物活性蛋白質(zhì)的藥代 動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，其中藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)通過測(cè)定施用于受試者的生物活性蛋白質(zhì)的血漿半衰期 與連接到生物活性蛋白質(zhì)并以相當(dāng)?shù)膭┝渴┯糜谑茉囌叩木鄱嚯娜诤系鞍讈泶_定。
[0010] 在上述實(shí)施方案的一些情況中，沒有一種類型的氨基酸占聚多肽序列的50%以 上，沒有任何一種類型的氨基酸會(huì)連續(xù)出現(xiàn)。
[0011] 在一些情況中，分離的具有上述實(shí)施方案的聚多肽的融合蛋白包括胰島素、胰島 血糖素樣肽-1、胰高血糖素、蜥外泌肽-4、生長激素、促卵泡激素、甲狀腺激素、降鈣素、促紅 細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、胰島素樣生長因子-1、干擾素_α、干擾素_β、干擾素-γ、 人成纖維細(xì)胞因子-21、白介素-IRa、白介素-2、凝血因子Vila、天冬酰胺酶、凝血因子VIII、 凝血因子IX及其他蛋白類或多肽藥物。
[0012] 在一些實(shí)施方案中，所得融合蛋白的增強(qiáng)的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)包括血漿半衰期提高 至至少5倍。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的融合蛋白與未連接到聚多肽的生物活性蛋白質(zhì)相比可 以具有較低的免疫原性，其中通過在給受試者施用相當(dāng)劑量后測(cè)定選擇性結(jié)合生物活性蛋 白質(zhì)的IgG抗體的產(chǎn)生確定免疫原性。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的融合蛋白，與聚多肽進(jìn)行融合的蛋白 其表現(xiàn)出與表24的序列至少大約90 %的序列同一性。其中聚多肽包含超過大約100至大約 5000個(gè)氨基酸殘基，其中該聚多肽的特征在于甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、絲氨酸（S)、蘇氨酸 (T)、脯氨酸（P)和賴氨酸(K)六種氨基酸殘基的總和占聚多肽總氨基酸序列的超過大約 95%以上;通過G0R算法確定，該聚多肽序列至少具有95 %的無規(guī)則卷曲形成;通過Chou-Fa s ma η算法確定，該聚多肽序列具有α螺旋和β折疊的總和小于2 %。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的融合蛋白與含有大量谷氨酸殘基的帶有 顯著負(fù)電荷的聚多肽的融合蛋白相比，具有較高的對(duì)相應(yīng)靶受體的結(jié)合親和力。在一個(gè)實(shí) 施方案中，該聚多肽融合蛋白表現(xiàn)出與靶受體的結(jié)合，其范圍為帶有負(fù)電荷的聚多肽的融 合蛋白的相應(yīng)靶受體的結(jié)合能力的大約120%_150%。
[0016] 其中，與該聚多肽進(jìn)行融合的蛋白可以設(shè)計(jì)為具有不同的融合方式，可以在生物 活性蛋白質(zhì)的Ν端或者C端融合，可以根據(jù)不同的需求，選擇不同的融合位置。
[0017] 其中，與該聚多肽進(jìn)行融合的蛋白可以融合不止一個(gè)的生物活性蛋白質(zhì)；融合蛋 白中也可以含有不止一個(gè)聚多肽序列。
[0018] 本發(fā)明提供分離的核酸，其包含選自以下的多核苷酸序列：（a)編碼上述任一實(shí)施 方案的融合蛋白的多核苷酸及其多核苷酸的互補(bǔ)序列；（b)上述表達(dá)的任一表達(dá)載體進(jìn)一 步包含連接到多核苷酸序列的重組調(diào)節(jié)序列。
[0019] -種改善生物活性蛋白質(zhì)的性質(zhì)的方法，包括將生物活性蛋白質(zhì)連接到該聚多肽 以實(shí)現(xiàn)一種性質(zhì)的步驟，該性質(zhì)的特征在于：（a)連接到聚多肽的生物活性蛋白質(zhì)的血漿半 衰期比未連接到聚多肽的生物活性蛋白質(zhì)的血漿半衰期長；（b)因聚多肽本身完全不帶電 荷的性質(zhì)，連接到聚多肽的生物活性蛋白質(zhì)與未連接到聚多肽的生物活性蛋白質(zhì)相比，生 物活性并未有顯著改變；（c)連接到聚多肽的生物活性蛋白質(zhì)在生理?xiàng)l件下的溶解度比未 連接到聚多肽的生物活性蛋白質(zhì)的溶解度提高；（d)當(dāng)施用于受試者時(shí)選擇性結(jié)合連接到 聚多肽的生物活性蛋白質(zhì)的IgG抗體的產(chǎn)生比當(dāng)以相當(dāng)?shù)膭┝肯蚴茉囌呤┯梦催B接到聚多 肽的生物活性蛋白質(zhì)時(shí)IgG的產(chǎn)生減少；（e)連接到聚多肽的生物活性蛋白質(zhì)當(dāng)比未連接到 聚多肽的生物活性蛋白質(zhì)施用于受試者時(shí)只需要更低的給藥頻率。
[0020] 有益效果
[0021] 1.本發(fā)明首次利用建庫篩選的方法得到穩(wěn)定的、無結(jié)構(gòu)的、低免疫原性的由甘氨 酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸和賴氨酸中的3-6種類型的氨基酸構(gòu)成的各種長度的聚 多肽，并且因?yàn)榫鄱嚯男蛄惺强芍貜?fù)的，相較于基本非重復(fù)序列可以利用構(gòu)建的篩選系統(tǒng) 進(jìn)行快速的篩選，即降低了篩選工作量又保證了聚多肽優(yōu)越的性質(zhì)。
[0022] 2.本發(fā)明構(gòu)建的聚多肽模擬PEG修飾技術(shù)，可以通過顯著的增加流體動(dòng)力學(xué)體積 從而顯著延長半衰期，此新型聚多肽隨著序列長度的增加，融合蛋白的半衰期會(huì)出現(xiàn)高于 比例的延長;并且該聚多肽克服了原有帶顯著負(fù)電荷聚多肽易降低與靶受體親和力的缺 點(diǎn)。
[0023] 3.本發(fā)明構(gòu)建并表達(dá)了多種聚多肽與生物活性蛋白質(zhì)的融合蛋白，具有增強(qiáng)穩(wěn)定 性、延長半衰期、降低免疫原性、不改變生物活性等諸多優(yōu)點(diǎn)，其有望成為生物活性分子的 新型改造策略。
【附圖說明】
[0024]本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)可以參考以下詳細(xì)說明和闡述說明性實(shí)施方案的附圖進(jìn)一 步解釋。
[0025]圖1顯示聚多肽融合蛋白的原理示意圖。FGF21為示意分子，聚多肽可以和任意多 肽或蛋白質(zhì)藥物融合表達(dá)。圖中顯示的表達(dá)載體，可以為真核表達(dá)載體或者為原核表達(dá)載 體。聚多肽可以連接在生物活性大分子藥物的N端或者C端，這取決于生物活性分子的活性 中心而定。圖中的聚多肽長度可以為多種長度，長度可按照對(duì)于融合蛋白的半衰期的要求 而定。
[0026] 圖2是聚多肽基因的示例性多核苷酸構(gòu)建體的示意圖。各氨基酸序列（如9氨基酸 或10氨基酸序列)通過自連接反應(yīng)連接得到更長的序列，將聚多肽插入GFP篩選載體的BspQ I位點(diǎn)。BspQ I位點(diǎn)始終位于插入片段的5'端，可根據(jù)需求不斷插入序列，從而達(dá)到我們需 要的長度，進(jìn)行篩選。
[0027] 圖3是聚多肽裝配、生產(chǎn)和評(píng)價(jià)的典型步驟的示意流程圖。短序列文庫的裝配是隨 機(jī)的過程，必然會(huì)出現(xiàn)短序列的連續(xù)重復(fù)出現(xiàn)，因此聚多肽序列中短序列是可重復(fù)的，并且 會(huì)有一定的比值。
[0028] 圖4是改造的篩選質(zhì)粒DMT-GFP示意圖及酶切鑒定圖。圖B中顯示一種篩選載體，來 自于多點(diǎn)突變pET28a( + )載體而得。通過單酶切鑒定，該載體只含有一個(gè)BspQ I位點(diǎn)。圖A瓊 脂糖核酸電泳中1泳道為pET28a-GFP質(zhì)粒，2泳道為pET28a-GFP質(zhì)粒BspQ I單酶切，3泳道為 DMT-GFP質(zhì)粒，4泳道為DMT-GFP質(zhì)粒BspQ I單酶切。
[0029] 圖5是短序列自連接反應(yīng)瓊脂糖電泳圖。
[0030] 圖6顯示包含GFP和聚多肽序列的所示構(gòu)建圖的表達(dá)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。使用