稻瘟病抗性相關(guān)基因OsCOL9的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種水稻抗病基因的應(yīng)用，具體涉及一 種稻瘟病抗性相關(guān)基因0SC0L9的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻(Oryza Sativa)是世界上重要的糧食作物之一，養(yǎng)活著全球半數(shù)以上的人口 (Khush，2005)，也是我國(guó)近一半人口的主要食物來(lái)源（劉國(guó)權(quán)等，2004)。由稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzae)侵染引起的稻痕病，是水稻生產(chǎn)上的重要限制因素 （Liu et al， 2013)，它具有傳播速度快、發(fā)生范圍廣、危害嚴(yán)重等特點(diǎn)。流行年份，稻瘟病重病區(qū)一般造 成水稻減產(chǎn)10%~20%，有時(shí)達(dá)40%~50%，局部田塊甚至顆粒無(wú)收，嚴(yán)重威脅著水稻的生 產(chǎn)(Pennisi，2010)。聚合多個(gè)主效抗病基因培育水稻新品種是目前防治稻瘟病最為經(jīng)濟(jì)有 效的手段(雷財(cái)林等，2004)。在長(zhǎng)期與稻瘟病共同進(jìn)化的過(guò)程中，水稻演化出許多針對(duì)不同 稻瘟病菌生理小種的抗病基因，通過(guò)遺傳鑒定已報(bào)道了68個(gè)位點(diǎn)約83個(gè)基因，其中絕大多 數(shù)基因都編碼含有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)與富亮氨酸重復(fù)序列的蛋白（Liu et al ,2013)。受稻瘟 病菌侵染后，水稻會(huì)通過(guò) PTI(PAMP trigger immunity)與 ETI(effector trigger immunity)兩個(gè)途徑實(shí)現(xiàn)免疫反應(yīng)。PTI主要是受病原菌關(guān)聯(lián)分子模式(PAMP)誘發(fā)的免疫反 應(yīng)，真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)，細(xì)菌外層的肽聚糖、鞭毛蛋白等小分子物質(zhì)都能夠激活水稻細(xì)胞 膜受體蛋白從而誘發(fā)初級(jí)免疫系統(tǒng)ΡΤΚΕΤΙ由病原菌釋放的效應(yīng)蛋白觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境免疫 反應(yīng)，ΕΤΙ發(fā)生后植物會(huì)出現(xiàn)R0S爆發(fā)、釋放植保素、形成組織局部壞死等多種反應(yīng)，該途徑 是植物最主要的免疫形式（Jabs et al，1997;Friedman and Baker，2007;Dangl and Jones,2001) 〇
[0003] 不論P(yáng)TI還是ETI途徑，轉(zhuǎn)錄因子都參與了抗病信號(hào)傳導(dǎo)，如Xa21是PAMP的病程識(shí) 別蛋白，通過(guò)與AvrXa21相互作用介導(dǎo)白葉枯抗性，Xa21在體內(nèi)剪切釋放胞內(nèi)激酶，該結(jié)構(gòu) 域與鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子WRKY62發(fā)生互作產(chǎn)生抗病反應(yīng)。Pbl編碼NBS-LRR類蛋白，且具有持 久的抗穗頸瘟特性，Pbl與WRKY45互作，使水楊酸表達(dá)量升高，Pbl所介導(dǎo)的抗病通路必須有 WRKY45的參與，該免疫反應(yīng)主要在ETI水平上進(jìn)行調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄因子的類型也非常豐富，包括 鋅指蛋白、同源異性結(jié)構(gòu)域、亮氨酸拉鏈、MYB等多個(gè)家族。這類轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物感受晝 夜節(jié)律變化及開(kāi)花過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，已有研究表明香蕉MaCOLl參與調(diào)控植物響應(yīng)生 物及非生物脅迫反應(yīng)，但C0、C0L類蛋白是否參與調(diào)控稻瘟病抗性的有關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。
[0004] 鑒定抗病相關(guān)基因有助于深入揭示水稻的抗病機(jī)理及水稻與病原菌的具體互作 機(jī)制，進(jìn)一步的選育或者培育相關(guān)的抗病品種，可以更好的更好地控制和降低稻瘟病菌對(duì) 水稻的危害，增強(qiáng)植物的抗病性。這些研究對(duì)水稻基因功能研究及抗病水稻育種都具有重 要的應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種稻瘟病抗性相關(guān)基 因 Os⑶L9的應(yīng)用。該基因?qū)儆贑OL家族轉(zhuǎn)錄因子，受稻瘟病菌誘導(dǎo)后表達(dá)量增加。該基因過(guò) 量表達(dá)可以顯著提高水稻稻瘟病抗性?？梢岳帽景l(fā)明基因構(gòu)建水稻過(guò)表達(dá)載體，應(yīng)用于 提高水稻的稻瘟病抗性。
[0006] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 本發(fā)明提供一種稻瘟病抗性相關(guān)基因0SC0L9在提高水稻對(duì)稻瘟病抗性中的應(yīng)用。 [0008]本發(fā)明提供一種稻瘟病抗性相關(guān)基因〇sCOL9在水稻抗稻瘟病育種中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明在稻瘟病菌接種后水稻的差異轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可被稻瘟病菌顯 著誘導(dǎo)的基因0sC0L9,該基因編碼蛋白含有保守的gCT/B互ox gnic finger Transcription Factor結(jié)構(gòu)域，屬于C0(C0NSTANS)、C0L(C0NSTANS-like)家族的成員。
[0010] 本發(fā)明涉及植物基因克隆以及功能分析，提供了一個(gè)提高水稻稻瘟病抗性的新基 因0sC0L9,該基因位于3號(hào)染色體上，基因座位號(hào)為L(zhǎng)0C_0s03g50310(MSU登錄號(hào)），其全長(zhǎng)基 因組序列為2759bp(SEQ ID N0:1)括5'非翻譯區(qū)（51TRK2個(gè)外顯子、1個(gè)內(nèi)含子和3'非翻 譯區(qū)（3'UTR)(圖1)。其cDNA全長(zhǎng)1266bp(SEQ ID N0:2)，編碼421個(gè)氨基酸。0sC0L9編碼的蛋 白質(zhì)序列如SEQIDN0:3所示，存在有CCT/BBox結(jié)構(gòu)域。
[0011]本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體和宿主菌以及擴(kuò)增該基因的任一片 段的引物。
[0012] 本發(fā)明稻瘟病抗性相關(guān)基因0sC0L9的應(yīng)用，該基因受稻瘟病病原菌誘導(dǎo)后表達(dá)量 增加。該基因受水稻稻瘟病菌的誘導(dǎo)后上調(diào)表達(dá)，過(guò)量表達(dá)能明顯提高水稻稻瘟病的抗性。
[0013] 將Os⑶L9與Ubi啟動(dòng)子構(gòu)建植物過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻，結(jié)果該基因過(guò)量表達(dá)可以 顯著提高稻瘟病抗性?？梢岳帽景l(fā)明基因構(gòu)建成表達(dá)載體，應(yīng)用于水稻抗稻瘟病育種中。
[0014] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0015]本發(fā)明方法利用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)從水稻中克隆到了一個(gè)含CCT/B BOX結(jié)構(gòu)域蛋白 的基因0sC0L9,證實(shí)0sC0L9參與了水稻對(duì)稻瘟病菌的防御反應(yīng)，是一種重要的參與水稻抗 病性的基因。本發(fā)明有助于更好地了解0sC0L9的作用機(jī)制，0sC0L9的克隆為進(jìn)一步了解水 稻-稻瘟病菌互作，抗病信號(hào)傳導(dǎo)通路奠定基礎(chǔ)，在育種中有較大的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1是0s⑶L9全長(zhǎng)基因組結(jié)構(gòu)示意圖；其中，黑色區(qū)域?yàn)橥怙@子，空白長(zhǎng)方格區(qū)域 為5'非翻譯區(qū)與3'非翻譯區(qū)。
[0017] 圖2是0s⑶L9與其它⑶L家族蛋白氨基酸序列相似性比較;其中，黑色背景區(qū)域?yàn)?保守的結(jié)構(gòu)域ΒΒ0Χ與CCT。
[0018] 圖3是0sC0L9在抗病材料中的表達(dá)受到稻瘟病菌的誘導(dǎo)的結(jié)果圖。
[0019] 圖4是p0X-0sC0L9過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建;其中，泳道Μ為lkb DNA Marker，泳道1~4 為過(guò)量表達(dá)載體P〇X_〇sCOL9酶切(KpnI/BamHI)鑒定結(jié)果。
[0020] 圖5是接種稻瘟病菌8d后P0X-0SC0L9轉(zhuǎn)化植株的病情調(diào)查;其中，中二軟占為未轉(zhuǎn) 化植株;P〇X-〇sCOL9為0sC0L9過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化株。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0022] 本發(fā)明所使用的各種原料及各項(xiàng)設(shè)備均為常規(guī)市售產(chǎn)品，均能夠通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買直 接獲得，所用引物序列均由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。
[0023] 所述的中二軟占在文獻(xiàn)"優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)水稻新品種中二軟占[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001， (〇6) :49·" 中公開(kāi)。
[0024] 所述的水稻高抗稻瘟病株系H4在文獻(xiàn)"水稻抗稻瘟病蛋白Pik2_H4基因的克隆及 互作蛋白的篩選[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014,（04): 156-160."中公開(kāi)。
[0025] 所述的稻痕病菌(Magnaporthe oryzae)GD0193在文獻(xiàn)"3個(gè)空間誘變水稻品系的 稻瘟病抗性評(píng)價(jià)及抗性遺傳分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33(03): 273-276中公開(kāi)。 [0026]所述的過(guò)量表達(dá)載體pOX在文獻(xiàn)"水稻SDG711和SDG723的克隆與功能分析[D].華 南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012"中公開(kāi)。
[0027]實(shí)施例1水稻0sC0L9基因的克隆以及序列分析 [0028] 1)水稻總RNA的提取
[0029]取中二軟占（Zhongerruanzhan)(在文獻(xiàn)"優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)水稻新品種中二軟占[J].中國(guó) 農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，（06):49."中公開(kāi))及其水稻高抗稻瘟病株系H4(近等基因系H4)(在文獻(xiàn) "水稻抗稻瘟病蛋白Pik 2_H4基因的克隆及互作蛋白的篩選[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014,（04): 156-160中公開(kāi))四葉期水稻幼苗，在陶瓷研缽中用液氮冷凍并研磨成粉狀，轉(zhuǎn)入1.5mL離 心管，并按照每l〇