一種針對人源抗體Fc片段的納米抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種針對人源抗體Fc片段的納米抗體及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)或生物 醫(yī)學領(lǐng)域技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗體(Antibody)是一種由機體免疫系統(tǒng)針對外源物質(zhì)（如細菌、病毒的蛋白）所產(chǎn) 生的一種球狀蛋白質(zhì)，因此又被稱為免疫球蛋白（Ig)?？贵w通常由B細胞產(chǎn)生，在機體的免 疫系統(tǒng)中行使多種生理學功能?？贵w有多種類型，其中由B細胞分化而來的漿細胞所分泌的 IgG型抗體是最普遍、最重要的一種類型，通常存在于脊椎動物的體液中，在成人的血液中 含量能達到約l〇g/L。通常人們所說的抗體，即是指IgG型抗體?？贵w是由兩條相同的重鏈和 兩條相同的輕鏈通過二硫鍵結(jié)合形成的、對稱的Y型結(jié)構(gòu)，Y型結(jié)構(gòu)的兩臂末端是抗原結(jié)合 的部位，被稱為Fab片段，Y型的柄部被稱為Fc片段。
[0003] 由于抗體能夠高效、特異地與體內(nèi)和體外的各種抗原蛋白結(jié)合，使得抗體不僅能 應(yīng)用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能，還可以應(yīng)用于各種高靈敏的檢測方法。目前，抗體藥物是生物技 術(shù)藥物最重要的組成部分，抗體試劑也是醫(yī)學診斷和生物學研究中最常用到的試劑之一。 因此，抗體相關(guān)的生物產(chǎn)品具有極高的應(yīng)用前景和商業(yè)價值?？贵w可以通過多種途徑獲得， 例如:動物或人的血液、細胞培養(yǎng)、注射雜交瘤細胞的鼠的腹水等，但這均需要有效的方法 進行純化，以獲得具有應(yīng)用價值的抗體產(chǎn)品。目前最常用的抗體純化方法是利用特殊蛋白 質(zhì)與抗體的Fc片段之間的高親和力進行親和層析。在進行抗體產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)的過程中， 親和層析是其中最為關(guān)鍵的一步，也是整個生產(chǎn)中耗費最高的部分。
[0004] 目前，純化抗體普遍使用Protein A或Protein G偶聯(lián)的交聯(lián)瓊脂糖進行親和層 析。但是，使用Protein A/G進行抗體純化，首先要進行Protein A/G的表達和純化，而 Protein A/G通常表達量較低，這就大大增加了抗體親和層析的成本。在科研方面，有大量 蛋白質(zhì)采用融合人源Fc片段進行表達，以便識別和純化，這都需要獲得針對人源抗體Fc片 段的抗體。
[0005] 因此，人們一直在努力探究新的方法來克服這些困難，針對人Fc片段的新型納米 抗體將有可能解決這一難題。納米抗體是來源于駱駝科動物或軟骨魚的特殊抗體。研究表 明，駱駝體內(nèi)存在一種天然缺失輕鏈只含重鏈的抗體，稱為重鏈抗體?？寺≈劓溈贵w的可變 區(qū)可得到只由一個重鏈可變區(qū)組成的單域抗體，稱為VHH抗體。VHH抗體的晶體直徑僅有 2.5nm，長4nm，因此又被稱為納米抗體。納米抗體的大小只有傳統(tǒng)IgG型抗體的十分之一，是 天然存在的可與抗原結(jié)合的最小片段。納米抗體能被單基因編碼，可以很容易的利用微生 物進行生產(chǎn)，并具有很高的產(chǎn)率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明篩選獲得Anti-Fc的納米抗體，并建立 基于抗人源Fc片段納米抗體的親和層析方法，用于替代Protein A/G，以降低實驗室和工業(yè) 化在純化人源抗體和含人源抗體Fc片段的融合蛋白時的成本。
[0007] 技術(shù)方案:為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種針對人源抗體Fc片段的納 米抗體，所述納米抗體具有SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、 SEQIDN0:25所示的氨基酸序列的VHH鏈，其編碼核苷酸序列如SEQIDN0:26、SEQIDN0 : 27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30所示。
[0008] 作為優(yōu)選，所述VHH鏈包括框架區(qū)FR和互補決定區(qū)⑶R;
[0009] 所述框架區(qū)FR包括?1?1^1?2^1?^1?4的氨基酸序列，其氨基酸序列分別為：
[0010] SEQIDNO:0；f*FRl，SEQIDNO:2m*FR2，SEQIDNO:3m*FR3，SEQIDNO:4 所示FR4;
[0011] SSEQIDN0:8K*FRl，SEQIDN0:2m*FR2，SEQIDN0:3m*FR3，SEQIDN0: 4所示FR4;
[0012] SSEQIDNO:l(^；f*FRl，SEQIDNO:10；f*FR2，SEQIDNO:12K*FR3，SEQID 從):4所示卩尺4;
[0013] SSEQIDN0:16K*FR1，SEQIDN0:2**FR2，SEQIDN0:3K*FR3，SEQID 從):4所示卩尺4;
[0014] SSEQIDN0:8K*FR1，SEQIDN0:2**FR2，SEQIDN0:17K*FR3，SEQID 從)：18所示卩尺4;
[0015] 所述互補決定區(qū)CDR包括CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，對應(yīng)上述各FR，所述CDR 的氨基酸序列分別為：
[0016] SEQIDN0:5K*CDR1，SEQIDN0:6K*CDR2，SEQIDN0:7K*CDR3;
[0017] SSEQIDN0:9K*CDR1，SEQIDN0:6K*CDR2，SEQIDN0:7K*CDR3;
[0018] 或SEQ ID NO :13所示CDR1，SEQ ID NO :14所示CDR2, SEQ ID NO :15所示CDR3;
[0019] SSEQIDN0:9K*CDR1，SEQIDN0:6K*CDR2，SEQIDN0:7K*CDR3;
[0020] 或SEQ ID NO :19所示CDR1，SEQ ID NO :20所示CDR2, SEQ ID NO :7所示CDR3。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種DNA分子，其編碼上述針對人源抗體Fc片段的納米抗體，其核 苷酸序列如SEQ ID N0:26、SEQ ID N0:27、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29、SEQ ID N0:30所 不。
[0022] 本發(fā)明還提供了 一種表達載體，其包含上述DNA分子的核苷酸序列。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種宿主細胞，其表達上述針對人源抗體Fc片段的納米抗體。
[0024] 本發(fā)明還提供了所述針對人源抗體Fc片段的納米抗體在分離純化人源抗體中的 應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明還提供了所述針對人源抗體Fc片段的納米抗體在分離純化含人源抗體Fc 標簽的融合蛋白中的應(yīng)用。
[0026] 本發(fā)明最后還提供了所述人源抗體Fc片段納米抗體在檢測人源抗體Fc片段中的 應(yīng)用。
[0027] 技術(shù)效果:相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下技術(shù)優(yōu)勢：
[0028] 本發(fā)明采用人源抗體Fc片段免疫新疆雙峰駝，隨后利用該駱駝外周血淋巴細胞建 立針對人源抗體Fc片段的納米抗體基因文庫，將人源抗體Fc片段偶聯(lián)在酶標板上，以此形 式的抗原利用噬菌體展示技術(shù)篩選免疫性的納米抗體基因庫，從而獲得了針對人源抗體Fc 的高親和力和高特異性的納米抗體的基因，將此基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，建立了能在大腸桿 菌中高效表達的納米抗體株，根據(jù)序列比對軟件分析各個克隆株的基因序列，獲得針對人 源抗體Fc片段的納米抗體VHH鏈的氨基酸序列，并證明該納米抗體可以和人源抗體Fc片段 特異性結(jié)合，從而用于對人源抗體和偶聯(lián)人源抗體Fc片段的重組蛋白的純化。
【附圖說明】
[0029] 圖1是對所構(gòu)建的噬菌體展示納米抗體文庫進行插入率檢測的菌落PCR的電泳圖， 其中泳道1是DNA分子marker，泳道2-25是所構(gòu)建的針對人源抗體Fc片段的納米抗體文庫中 隨機挑取得克隆PCR檢測電泳圖；
[0030] 圖2是表達的針對人源抗體Fc片段的納米抗體，經(jīng)鎳樹脂親和層析純化后的SDS-PAGE電泳圖，泳道1是蛋白marker，泳道1-4是經(jīng)鎳樹脂親和層析純化后的納米抗體。
[0031] 圖3是以人源抗體Fc片段的納米抗體為核心材料對人源抗體的富集和對偶聯(lián)人源 化Fc片段蛋白的純化的示意圖。附圖標記：1.人源血清或含人源抗體Fc片段及人源抗體Fc 片段融合蛋白的蛋白裂解液;2.抗人源抗體Fc片段的納米抗體;3.人源抗體;4.人源抗體Fc 片段及人源抗體Fc片段融合蛋白。
【具體實施方式】
[0032]下面結(jié)合附圖進一步描述本發(fā)明的具體實施方案。
[0033] 本發(fā)明采用人源抗體Fc片段免疫新疆雙峰駝，經(jīng)過7次免疫之后提取該雙峰駝外 周血淋巴細胞并建立人源抗體Fc片段特異的納米抗體文庫。將人源抗體Fc片段偶聯(lián)在酶標 板上，展示正確的空間結(jié)構(gòu)，使得人源抗體Fc片段的抗原表位得以暴露出來，以此形式的抗 原利用噬菌體展示技術(shù)篩選人源抗體Fc片段免疫性的納米抗體基因庫(駱駝重鏈抗體噬菌 體展示基因庫），而獲得了能在大腸桿菌中高效表達的納米抗體株。
[0034] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。
[0035] 實施例1:針對人源抗體Fc片段的納米抗體文庫的構(gòu)建：
[0036] (1)將lmg人源抗體Fc片段(源自于康寧杰瑞)抗原與弗氏佐劑等體積混合，免疫一 只新疆雙峰駝，每周一次，共連續(xù)免疫7次，免疫過程中刺激B細胞表達特異性的納米抗體； (2)7次免疫結(jié)束后，提取駱駝外周血淋巴細胞100ml并提取總RNA; (3)合成cDNA并利用套式 PCR擴增VHH; (4)利用限制性內(nèi)切酶PstI及Notl酶切20ug pMECS噬菌體展示載體及10ug VHH并連接兩種片段；（5)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞TG1中，構(gòu)建人源抗體Fc片段納 米抗體噬菌體展示文庫并測定庫容，庫容的大小約為1.2 X108;于此同時，通過菌落PCR檢 測所建文庫的插入率，圖1顯示菌落PCR結(jié)果，隨機的選取24顆克隆做菌落PCR，結(jié)果顯示插 入率達到95