凝血因子xiii的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種以人類血液或哺乳動(dòng)物血液為原料 制備醫(yī)用凝血因子XIII的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 凝血因子XIII(又稱纖維蛋白穩(wěn)定因子、纖維蛋白連接酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶)是以酶 原(A2B2四聚體，Mr ? 320KD)形式存在于血漿中的一種糖蛋白，是正常凝血所必需的一種血 漿蛋白酶，被激活后發(fā)揮轉(zhuǎn)氨酶的作用，可催化可溶性纖維蛋白單體(sFM)分子間的交聯(lián)反 應(yīng)，形成γ鏈二聚體以及大分子量的α鏈多聚體，增加血塊強(qiáng)度，加速傷口愈合。
[0003] 目前國內(nèi)外的凝血因子XIII的制備主要從人血漿、酵母細(xì)胞中提取，還有從血小 板、胚胎中提取，臨床上使用時(shí)再經(jīng)凝血酶催化，在Ca 2+參與作用下，轉(zhuǎn)變成具有活性的如結(jié) 構(gòu)，催化纖維蛋白凝膠進(jìn)一步共價(jià)交聯(lián)成不溶的血纖維蛋白凝塊。
[0004] 凝血因子XIII制品可從人或動(dòng)物豬血液中提取，我國是畜牧大國，養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模較 大，豬血資源十分豐富，由于生產(chǎn)工藝不夠成熟，導(dǎo)致目前我國豬血的利用率很低。從豬血 中提取FXIII既可以充分利用豬血資源，又可以減少因排放而造成的環(huán)境污染。FXIII的缺 乏會(huì)導(dǎo)致遲發(fā)性出血、表面擦傷出血、皮下血腫、組織損傷出血、口腔粘膜和牙齦出血常見， 更為常見的是運(yùn)動(dòng)損傷或肌肉注射引起肌肉血腫。此外，F(xiàn)XIII對(duì)治療手術(shù)后傷口愈合紊 亂、硬皮病、潰瘍性結(jié)腸炎、偽膜性結(jié)腸炎等很有效。FXIII也是組織粘合劑的重要成分之 〇
[0005] 凝血因子XIII是一種糖蛋白，一般的凝血因子XIII的提取包括六個(gè)基本步驟，即 血漿血球分離、病毒滅活、硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-FF層析柱、進(jìn)行分裝和凍干，最后經(jīng)干熱 病毒滅活和鈷-60輻照。但是上述工藝存在以下缺陷：
[0006] 生產(chǎn)的過程中三次溶解的時(shí)間太長，這個(gè)過程中容易導(dǎo)致細(xì)菌等微生物繁殖，從 而增加產(chǎn)品中熱原等毒素的含量;溶解時(shí)間過長也容易造成活性損失，同時(shí)延長生產(chǎn)周期， 增加成本;上述工藝制得的產(chǎn)品，純度不高，活性較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:提供一種得率高、純度高且生產(chǎn)周期短的凝血因 子XIII的制備方法。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:凝血因子XIII的制備方法，包 括如下步驟：
[0009] 步驟1、向血液中加入抗凝劑后離心分離，取上清抗凝血漿；
[0010]步驟2、向上清抗凝血漿中加入磷酸三丁酯和吐溫-80作為病毒滅活劑，并加入助 劑，進(jìn)行S/D病毒滅活，得滅活后的血漿；
[0011] 步驟3、將步驟2所得滅活后的血漿離心，取清液；
[0012] 步驟4、將步驟3所得清液預(yù)冷至0~4°C，加入0~4°C的飽和硫酸銨溶液后，取沉 淀；
[0013] 步驟5、將步驟4所得沉淀用0~4°C的飽和硫酸銨溶液洗滌，將洗滌后的沉淀破碎 并加入0~4°C的一次溶解劑并攪拌，取清液，所述一次溶解劑為氯化鉀溶液；
[0014] 步驟6、將步驟5所得清液預(yù)冷至0~4°C，加入0~4°C的乙酸體積分?jǐn)?shù)為94 %~ 96 %的乙酸溶液至溶液pH為5.2~6.5后，加入硫酸銨固體至溶液飽和度為15 %~20 %，取 沉淀；
[0015] 步驟7、向步驟6所得沉淀中加入0~4°C的二次溶解劑并攪拌，取清液，所述二次溶 解劑為含有氯化鈉的緩沖液，所述緩沖液中的緩沖對(duì)為Tris-HCl、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉 和檸檬酸鹽-磷酸鹽中的任一種；
[0016] 步驟8、將步驟7所得清液水浴加熱至53~56°C，維持160~200秒后冷卻至0~4°C， 取清液；
[0017] 步驟9、向步驟8所得清液中加入硫酸銨固體至溶液飽和度為35%~40%，取沉淀； [0018]步驟1〇、向步驟9所得沉淀中加入0~4°C的三次溶解劑并攪拌，取清液，所述三次 溶解劑為含有氯化鉀的Tr i s-HCl緩沖液；
[0019] 步驟11、將步驟10所得清液梯度洗脫后冷凍干燥，即得凝血因子XIII凍干制品。
[0020] 本發(fā)明的有益效果在于:在溶解時(shí)加入不同的溶解劑，同時(shí)使得沉淀中的凝血因 子XIII溶解充分同時(shí)大大縮短溶解時(shí)間，減少細(xì)菌滋生;提取效率高，每升血漿能提取10毫 克以上的凝血因子XIII;制得的凝血因子XIII凍干制品中，凝血因子XIII純度在90%以上； 操作簡(jiǎn)單，生產(chǎn)周期短，在2天時(shí)間內(nèi)即可完成凝血因子XIII的制備；制得的凝血因子XIII 凍干制品的復(fù)溶時(shí)間短，穩(wěn)定性好，保存時(shí)間長。
【附圖說明】
[0021 ]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1和實(shí)施例2的凝血因子XIII的制備方法的流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附 圖予以說明。
[0023] 本發(fā)明最關(guān)鍵的構(gòu)思在于:在病毒滅活時(shí)加入助劑，在0~4°C環(huán)境下進(jìn)行凝血因 子XIII的分級(jí)沉降、溶解過程，加入不同的溶解劑對(duì)沉淀進(jìn)行分級(jí)溶解，提高溶解效率，縮 短生產(chǎn)周期，減少細(xì)菌滋生，提高凝血因子XIII得率和純度。
[0024] 請(qǐng)參照?qǐng)D1，凝血因子XIII的制備方法，包括如下步驟：
[0025] 步驟1、向血液中加入抗凝劑后離心分離，取上清抗凝血漿；
[0026]步驟2、向上清抗凝血漿中加入磷酸三丁酯和吐溫-80作為病毒滅活劑，并加入助 劑，進(jìn)行S/D病毒滅活，得滅活后的血漿；
[0027] 步驟3、將步驟2所得滅活后的血漿離心，取清液；
[0028] 步驟4、將步驟3所得清液預(yù)冷至0~4°C，加入0~4°C的飽和硫酸銨溶液后，取沉 淀；
[0029] 步驟5、將步驟4所得沉淀用0~4°C的飽和硫酸銨溶液洗滌，將洗滌后的沉淀破碎 并加入0~4°C的一次溶解劑并攪拌，取清液，所述一次溶解劑為氯化鉀溶液；
[0030] 步驟6、將步驟5所得清液預(yù)冷至0~4°C，加入0~4°C的乙酸體積分?jǐn)?shù)為94 %~ 96 %的乙酸溶液至溶液pH為5.2~6.5后，加入硫酸銨固體至溶液飽和度為15 %~20 %，取 沉淀；
[0031] 步驟7、向步驟6所得沉淀中加入0~4°C的二次溶解劑并攪拌，取清液，所述二次溶 解劑為含有氯化鈉的緩沖液，所述緩沖液中的緩沖對(duì)為Tris-HCl、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉 和檸檬酸鹽-磷酸鹽中的任一種；
[0032] 步驟8、將步驟7所得清液水浴加熱至53~56°C，維持160~200秒后冷卻至0~4°C， 取清液；
[0033] 步驟9、向步驟8所得清液中加入硫酸銨固體至溶液飽和度為35%~40%，取沉淀； [0034]步驟10、向步驟9所得沉淀中加入0~4°C的三次溶解劑并攪拌，取清液，所述三次 溶解劑為含有氯化鉀的Tr i s-HCl緩沖液；
[0035] 步驟11、將步驟10所得清液梯度洗脫后冷凍干燥，即得凝血因子XIII凍干制品。 [0036]所述助劑為氨基酸、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、山梨醇、葡萄酸鈉、檸檬酸三鈉、EDTA中 的一種或幾種，助劑中的氨基酸為谷氨酸、賴氨酸、丙氨酸、組氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、精氨 酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸中的一種或幾種，所述助劑中的溶質(zhì)的濃度均為0.01~1. Omol/ L〇
[0037] 助劑能提高凝血因子XIII制品的質(zhì)量，在病毒滅活和沉降過程中起到保護(hù)凝血因 子XIII的生物學(xué)活性的作用。
[0038] 發(fā)明人在實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，由于在S/D病毒滅活后，由于病毒體被滅火劑破 壞，產(chǎn)生了大量變性的蛋白，同時(shí)滅活劑對(duì)血漿中的各種蛋白也有一定程度的破壞，導(dǎo)致蛋 白質(zhì)變性，產(chǎn)生各種不溶物，這些不溶物經(jīng)發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量，尤其是復(fù)溶速度 與產(chǎn)品純度具有不利影響，因此在滅活后加入離心分離步驟。
[0039]夾雜在沉淀中的S/D滅活劑、雜蛋白等對(duì)產(chǎn)品的復(fù)溶速度與品質(zhì)同樣有不利影響， 因此采用冷硫酸銨溶液作為洗滌劑，以洗去一次沉淀里的殘余的S/D滅活劑和雜蛋白；采用 0~4°C的飽和硫酸銨溶液作為洗滌劑是因?yàn)闇囟冗^高時(shí)，洗滌劑會(huì)溶解凝血因子XIII。 [00 40]其中，在上述梯度洗脫過程中，采用新型DEAE Sepharose FF填料，分離效果好。
[0041] 其中，所述血液為無菌采集的豬血液或人血液。其中，所述一次溶解劑中氯化鉀的 濃度為〇 · 1~〇 · 2mol/L。
[0042] 其中，所述二次溶解劑中氯化鈉的濃度為0.1~0.2mol/L，緩沖對(duì)的濃度為0.01~ 0 · 05mol/L，所述二次溶解劑的pH值為7 · 0~7 · 5。
[0043] 其中，所述三次溶解劑的pH值為8.0，三次溶解劑中氯化鉀的濃度為0.50mM，三次 溶解劑中Tris-HCL的濃度為10mM。
[0044] 其中，步驟11中進(jìn)行冷凍干燥前向梯度洗脫后的溶液中加入凍干保護(hù)劑，所述凍 干保護(hù)劑的溶質(zhì)選自多羥基碳水化合物、檸檬酸三鈉、氯化鈉、氨基酸中的一種或幾種。
[0045] 優(yōu)選的，所述凍干保護(hù)劑的溶質(zhì)為多羥基碳水化合物、檸檬酸三鈉、氯化鈉和氨基 酸;所述凍干保護(hù)劑中，多羥基碳水化合物的濃度為〇. 1 %~5 % w/v，氯化鈉的濃度為0.1 % ~0.9 % w/v，氨基酸的濃度為0.1 %~5 % w/v。本申請(qǐng)中w/v的單位均為g/mL，如"多羥基碳 水化合物的濃度為〇 . 1 %~5 表示，每100毫升溶液中含有0.1~5克的多羥基碳水化 合物，即多羥基碳水化合物的濃度為1~50g/L。
[0046]其中，所述多羥基碳水化合物選自蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露醇、