一種來源于馬克斯克魯維酵母的高表達啟動子及其表達系統(tǒng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物基因工程應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及包含一種來源于馬克斯克魯維酵 母的高表達啟動子和外泌信號肽、包含該啟動子和信號肽的重組載體、利用該載體在多種 酵母中實現(xiàn)目的基因的高表達方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 酵母細胞用于外源蛋白的分泌表達一直以來就被人們廣泛關(guān)注。酵母細胞以其適 于大規(guī)模生產(chǎn)、翻譯后修飾系統(tǒng)較為完善以及無內(nèi)毒素污染問題等優(yōu)點而被研究人員廣泛 應(yīng)用。但同樣酵母細胞也具有表達量不高、信號肽加工不完全導(dǎo)致不能分泌大蛋白等缺點。 目前，應(yīng)用廣泛同時也相對成熟的酵母表達系統(tǒng)包括釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、乳酸克魯維酵母等。但是，傳統(tǒng)的酵母表達體系在表達量和信號肽加工等方面 還有待進一步完善。
[0003] -些新型的非傳統(tǒng)酵母，特別是馬克斯克魯維酵母，具有生長快、底物譜廣泛、耐 受高溫等優(yōu)勢，受到了越來越多的關(guān)注，是極具開發(fā)前景的新型酵母表達系統(tǒng)和生物基化 學(xué)品和生物能源的生產(chǎn)菌株(Appl Microbiol Biotechnol，2008,79:339_354;FEMS Yeast Research，2015，15，1-13)。但截止目前，較為理想的啟動子和信號肽研究較少，同時能夠在 其中自主復(fù)制并能夠簡單篩選的表達系統(tǒng)也相對匱乏，這些問題最終導(dǎo)致了馬克斯克魯維 酵母至今無法廣泛應(yīng)用于各種蛋白的異源表達和基因工程改造。
[0004] 外源蛋白在宿主細胞內(nèi)的異源表達的前提在于攜帶目的基因的載體能夠在宿主 細胞內(nèi)進行自主的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，這一過程受制于不同宿主細胞內(nèi)不同的復(fù)制起 點。但是，與釀酒酵母和畢赤酵母相比，克魯維屬酵母作為宿主細胞的表達載體相對受限。 真正使得克魯維屬酵母作為表達宿主而被人們關(guān)注是由于pKDl質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)(Falcone et al. Plasmid，1986，15:248-252.)。含有pKDl質(zhì)粒復(fù)制起點的表達載體能夠保證其在釀酒酵 母、乳酸克魯維酵母和馬克斯克魯維酵母等中進行復(fù)制，并最終實現(xiàn)外源蛋白的表達。
[0005] 外源蛋白的表達量或者表達效率在很大程度上取決于選取的啟動子的轉(zhuǎn)錄活性 (PNAS，2005,102(36): 12678-12683)。目前應(yīng)用于克魯維屬表達系統(tǒng)的啟動子分為三類:其 自身啟動子、來源于釀酒酵母啟動子和非酵母啟動子，如Tet-off，且多使用釀酒酵母的啟 動子(Appl Microbiol Biotechnol，2013,97(5): 2029-41)。而蛋白的胞外表達借助于外泌 信號肽的介導(dǎo)，高效的信號肽同樣能夠幫助蛋白在胞外實現(xiàn)高表達量，并有利于進一步的 蛋白分離純化工作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種來源于馬克斯克魯維酵母的高表達啟動子(KmlNUl啟動子）、高效 外泌的信號肽及其相應(yīng)的表達系統(tǒng)。
[0007] 本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
[0008] 本發(fā)明的第一方面，提供一種高表達的啟動子，其核苷酸序列為(a)~（d)中的任 意一種：
[0009] (a)如SEQ ID No. 1表示的核苷酸序列；
[0010] (b)如SEQ ID No.2表示的核苷酸序列；
[0011] (C)截斷上述(a)的核苷酸序列獲得的核苷酸序列，其中截斷獲得的核苷酸序列包 含上述(b)的核苷酸序列；
[0012] (d)與上述（a)~（c)的核苷酸序列具有80%同源性并且在馬克斯克魯維酵母 (Kluyveromyces marxianus)和除馬克斯克魯維酵母以外的至少一種以上的酵母中具有啟 動子活性的核苷酸序列。
[0013] 上述高表達啟動子命名為KmlNUl啟動子。
[0014]本發(fā)明的第二方面，提供一種用于引導(dǎo)如上述所述的高表達啟動子(KmlNUl啟動 子)調(diào)控的外源蛋白分泌的信號肽，其特征在于，其核苷酸序列為(e)和(f)中的任意一種： [0015] (e)如SEQ ID No.3表示的核苷酸序列；
[0016] (f)與上述(e)的核苷酸序列具有80%同源性并且在馬克斯克魯維酵母和除馬克 斯克魯維酵母以外的至少一種以上的酵母中具有外泌蛋白能力的核苷酸序列。
[0017] 本發(fā)明的第三方面，提供一種載體，其包含上述所述的高表達啟動子(KmlNUl啟動 子)所述的高表達啟動子、上述所述的信號肽和能夠在該高表達啟動子的調(diào)控下工作的方 式配置的外源蛋白基因。
[0018] 進一步地，所述載體含有在酵母中擴增的復(fù)制起點序列、篩選標記URA3基因和卡 那霉素抗性基因，其中所述的復(fù)制起點序列如SEQ ID No.4。
[0019] 本發(fā)明上述所述的載體，帶有在克魯維酵母中擴增的復(fù)制起點，能夠在克魯維屬 酵母中實現(xiàn)目的基因的胞外高表達;且該載體帶有URA3基因和卡那霉素抗性基因，具有簡 單篩選特性。
[0020] 本發(fā)明的第四方面，提供一種轉(zhuǎn)化體，其通過將上述所述的載體導(dǎo)入酵母中而得 到。
[0021 ] 進一步地，所述的酵母為馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)乳酸克 魯維酵母(Kluyveromyces lactis)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的任意一 種。
[0022] 本發(fā)明的第五方面，提供一種外源蛋白基因的高表達方法，包括對上述所述的轉(zhuǎn) 化體進行培養(yǎng)的步驟。
[0023] 進一步地，上述所述的外源蛋白基因的高表達方法，還包括對培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體 中回收外源蛋白基因表達產(chǎn)物的步驟。
[0024] 與現(xiàn)有的克魯維屬的表達載體相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0025] (1)本發(fā)明所述的KmlNUl啟動子具有較強的轉(zhuǎn)錄啟動活性，不需要誘導(dǎo)物即可啟 動其下游基因的轉(zhuǎn)錄。并且該啟動子在很大程度上解除了酵母中普遍存在的碳源阻遏效 應(yīng)，在相對較高的碳源濃度條件下能夠保持較高的轉(zhuǎn)錄活性；
[0026] (2)本發(fā)明所述的外源蛋白表達載體含有高效的菊粉酶信號肽，能夠?qū)崿F(xiàn)外源蛋 白的胞外表達，為后續(xù)的分離純化奠定基礎(chǔ)；
[0027] (3)本發(fā)明所述的外源蛋白表達載體含有卡那霉素的抗性基因，能夠在酵母菌宿 主內(nèi)實現(xiàn)快速方便篩選；
[0028] (4)本發(fā)明所述的表達載體的蛋白表達量隨著時間逐漸積累，特別適合表達影響 細胞生長的蛋白。
【附圖說明】
[0029] 圖1是本發(fā)明提供的含有卡那抗性基因的載體PCXJ10-kan的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0030] 圖2是本發(fā)明提供的含有367bp KmlNUl啟動子和信號肽的胞外蛋白表達載體 pCXJ10-kan-PS的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0031 ]圖3是本發(fā)明提供的含有菊粉酶的表達載體pCXJ10-kan-inu的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0032]圖4是不同截斷長度的KmlNUl啟動子的啟動活性比較。
[0033]圖5是367bp KmlNUl啟動子進一步截斷的啟動活性比較。
[0034] 圖6是KmlNUl啟動子(如SEQ ID No. 1所示）的結(jié)構(gòu)與功能示意圖。
[0035]圖7是以乳酸克魯維酵母為宿主，綠色熒光蛋白為報告基因的KmlNUl啟動子和 KmPGK啟動子的活性比較。
[0036]圖8是在乳酸克魯維酵母中，KmlNUl啟動子啟動菊粉酶基因表達性能評價。
[0037]圖9是在馬克斯克魯維酵母中，KmlNUl啟動子啟動菊粉酶基因表達性能評價。
【具體實施方式】
[0038] 下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以 任何方式限制本發(fā)明。下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規(guī)方法，所 用材料、試劑等均可從生物或化學(xué)公司購買。
[0039] 本發(fā)明使用的材料：質(zhì)粒 pCXJ10(Gene, 1996,172:131-136)，NCBI GeneBank U34314;質(zhì)粒pYES2.0為Biovector公司的Biovector 104802;質(zhì)粒pFA6a_kanMX4 (Nucleotide sequence of the kanamycin resistance transposon Tn903, J.Mol .Biol · 1981，147(2) ,217-226)，GeneBank:AJ002680 · 1;質(zhì)粒pZQ03(張秋美·釀酒酵母 乙醇響應(yīng)報告載體的構(gòu)建和研究.大連理工大學(xué)碩士論文，2009)，帶有eGFP基因 (GeneBank: JQ064510.1);聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增試劑盒為Takara公司的產(chǎn)品PCR試劑 盒。
[0040] 本發(fā)明所用引物名稱以及其序列如表1，劃線部分為酶切位點。
[0041 ]表1.引物名稱以及其序列
[0042]
[0043]
[0044] 實施例1
[0045] (l)KmlNUl啟動子的獲取
[0046] 將鷹嘴豆胞克魯維酵母(Kluyveromyces (3；[061^8口01'118)0334857的基因組為模 板，Inu-1058(SEQIDNo.ll)和Inu-0(SEQ