篩選抗hppd抑制劑類除草劑基因的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體而言，涉及一種篩選抗HPPD抑制劑類除草劑基因 的方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 對羥基苯基丙酮酸雙氧化酶（4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，ΗΡΡ?)存 在于各種生物體中，它是一種鐵-酪氨酸蛋白，在植物體內(nèi)可將對羥基丙酮酸（4-Hydroxyphenylpyruvate，ΗΡΡ)催化為尿黑酸（2，5-dihydroxyphenylacetate，HGA)，進(jìn)而轉(zhuǎn) 化為光合作用中電子傳遞所需要的重要物質(zhì)質(zhì)體醌和生育酚，其中質(zhì)體醌還是影響八氫番 茄紅素去飽和酶催化的關(guān)鍵輔助因子。鑒于其上述重要作用和特點(diǎn)，HPH)成為繼ALS、ACC以 及Protox之后的又一新的除草劑靶標(biāo)酶。由于該酶抑制劑用于除草方面時(shí)具有廣譜、高效、 殘留低、環(huán)境相容性好、使用安全的特點(diǎn)，引起人們對其抑制劑研究的重視，該抑制劑的發(fā) 現(xiàn)對環(huán)境的保護(hù)有重大作用，這也是未來除草劑生產(chǎn)發(fā)展的趨勢。
[0003] 抗除草劑農(nóng)作物的種植，更充分地利用了除草劑的優(yōu)勢。在過去20年里，抗除草劑 作物給農(nóng)民和環(huán)境都帶來了巨大利益。目前生產(chǎn)上種植最多的是抗草甘膦玉米和大豆，從 而使草甘膦的施用非常廣泛。隨著草甘膦的大量使用，抗草甘膦雜草不斷出現(xiàn)，從而影響了 抗草甘膦作物的有效性。因此，開發(fā)新型抗除草劑作物，如抗HPPD抑制劑類除草劑作物，勢 在必行。
[0004] 本領(lǐng)域已有一些對抗除草劑HPPD基因的研究，但篩選抗除草劑HPPD基因仍然困 難。用植物直接篩選雖然其結(jié)果可直接應(yīng)用，但植物的生長繁殖周期長，傳代慢，因此篩選 效率非常低，難以用于實(shí)踐?？笻PPD抑制劑類除草劑HPPD基因的初步篩選往往是在細(xì)菌中 進(jìn)行。但這些篩選都需要先分離微生物菌株或?qū)PH)基因克隆在細(xì)菌中，再進(jìn)行單個(gè)評估。 這種方法工作量大、范圍廣、沒有針對性，難以進(jìn)行大規(guī)模篩選或從稀有樣品中進(jìn)行篩選。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種篩選抗HPro抑制劑類除草劑基因的方法，運(yùn)用此種方 法篩選抗HPro抑制劑類除草劑基因，不用對分離的個(gè)別菌株篩選，較傳統(tǒng)方法目標(biāo)性強(qiáng)，操 作簡便，可在短時(shí)間內(nèi)篩選得到較多的抗HPro抑制劑類除草劑基因，也容易從稀有樣品中 篩選得到抗HPro抑制劑類除草劑基因。
[0006] 一種篩選抗HPro抑制劑類除草劑基因的方法，包括如下步驟：
[0007] 1 )、將含有HPro抑制劑類除草劑抗性微生物的多種微生物在含有HPro抑制劑的抗 性篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到抗性菌種，并對其純化培養(yǎng)獲得單克??；
[0008] 2)、以所述單克隆的基因組為模板擴(kuò)增該單克隆的HPPD基因的開放閱讀框序列， 將擴(kuò)增產(chǎn)物連入質(zhì)粒中并于細(xì)菌中進(jìn)行原核表達(dá)，得到重組菌株；
[0009] 3)、對重組菌株的HPro抑制劑抗性進(jìn)行驗(yàn)證，獲得抗HPro抑制劑類除草劑基因。 [0010] HPFO即對羥基苯基丙酮酸雙氧化酶（4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase) 〇
[0011] 本發(fā)明針對現(xiàn)有的抗HPro抑制劑基因篩選方法中存在的不足，提供了一種快速而 有效地高通量篩選抗HPro抑制劑類除草劑基因的方法，運(yùn)用此種方法篩選抗HPro抑制劑類 除草劑基因，不用對分離的個(gè)別菌株篩選，較傳統(tǒng)方法目標(biāo)性強(qiáng)，操作簡便，可在短時(shí)間內(nèi) 篩選得到較多的抗HPro抑制劑類除草劑基因。
[0012] 優(yōu)選的，如上所述的篩選抗HPro抑制劑類除草劑基因的方法，在步驟1)中，所述培 養(yǎng)的具體過程為：
[0013] 將微生物樣本于含有HPPD抑制劑的抗性篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)1~10次，，且培養(yǎng)次數(shù) 大于1次時(shí)，在每相鄰兩次培養(yǎng)所用抗性篩選培養(yǎng)基中，后一次培養(yǎng)的HPro抑制劑濃度均不 低于前一次，且后一次培養(yǎng)的菌種來源于前一次培養(yǎng)中存活下來的微生物菌種。
[0014] 用此方法可篩選到針對不同濃度HPro抑制劑敏感的菌種，亦即該體系能夠快速篩 選出不同程度的抗HPro抑制劑類除草劑基因。
[0015]進(jìn)一步優(yōu)選的，在步驟3)中，抗性驗(yàn)證具體包括：
[0016]以步驟1)中篩選到的抗性菌種的HPPD抑制劑濃度為最高濃度設(shè)置HPPD抑制劑濃 度梯度，將步驟3)中所述重組菌株于HPPD抑制劑含量梯度設(shè)置的抗性篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 以篩選抗HPH)抑制劑類除草劑基因。
[0017]由于理論上重組菌株的HPro抑制劑抗性不會(huì)高于抗性菌種的HPro抑制劑抗性，所 以以抗性菌種的HPro抑制劑濃度為最高濃度。例如篩選到的抗性菌種能夠耐受的最高HPro 抑制劑為10mM硝磺草酮，則在步驟3)中，抗性篩選培養(yǎng)基的HPro抑制劑濃度梯度可設(shè)置為 0. lmM、0.5mM、ImM、2mM、5mM、10mM硝磺草酮。在具體的應(yīng)用中，步驟3)中用到的抗性篩選培 養(yǎng)基可能與步驟1)中略有不同，如在步驟1)中提供的抗性篩選培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上加上重 組菌株所具有抗性對應(yīng)的抗生素。
[0018]優(yōu)選的，如上所述的篩選抗HPPD抑制劑類除草劑基因的方法，所述HPPD抑制劑為 硝磺草酮或環(huán)磺酮。
[0019] 硝橫草酮（Mesotrione)又名甲基橫草酮，分子式C14H13NO7S，分子量339 · 32，CAS No: 104206-82-8。它是一類常用的HPH)抑制劑類除草劑的主要成分。
[0020] 環(huán)橫酮(Tembotrione)，是由拜耳公司報(bào)道的三酮類除草劑，分子式C17H16CIF3O6S， 分子量440.82, CAS No :335104-84-2。
[0021 ]進(jìn)一步優(yōu)選的，在步驟1)中：
[0022] HPH)抑制劑含量的范圍為1~20mM硝磺草酮或0.25~5mM環(huán)磺酮，相鄰濃度梯度設(shè) 置的間距為1.5~5倍。
[0023]相鄰濃度梯度設(shè)置的間距為1.5~5倍的含義即后一次培養(yǎng)中培養(yǎng)基的HPPD抑制 劑濃度是前一次培養(yǎng)中培養(yǎng)基的HPro抑制劑濃度的1.5~5倍。
[0024] 優(yōu)選的，如上所述的篩選抗HPro抑制劑類除草劑基因的方法，所述抗性篩選培養(yǎng) 基為含有1~20mM硝磺草酮或0.25~5mM環(huán)磺酮的SMNT基本培養(yǎng)基；
[0025] 按體積份數(shù)計(jì)，所述SMNT基本培養(yǎng)基包括以下組份：
[0026] 5XM9 鹽溶液200 份、245 ~255mM的MgS〇4溶液4.8份、97~103111]\1的〇3(：12溶液1份、 0.128%酪氨酸溶液778~784份、水9~11份；
[0027] 所述5XM9鹽溶液中包括：Na2HP〇4 · 7H20 60~68g/L、KH2P〇4l4~16g/L、NaCl 2.4 ~2.6g/L、NH4Cl 4.8~5.2g/L;
[0028] 所述5XM9鹽溶液、MgS〇4溶液、CaCl2溶液及0.128%酪氨酸溶液所用溶劑均為水。 [0029]若所篩選的微生物具有HPH)抑制劑抗性，則可在所述抗性篩選培養(yǎng)基中利用酪氨 酸，進(jìn)而合成質(zhì)體醌和生育酚從而存活下來。
[0030] 優(yōu)選的，如上所述的篩選抗HPro抑制劑類除草劑基因的方法，在步驟2)中：
[0031] 當(dāng)所述單克隆種屬未知時(shí)，則擴(kuò)增所述單克隆的部分16s rRNA序列，并將擴(kuò)增產(chǎn) 物測序以確定所述單克隆種屬；
[0032]根據(jù)得到的種屬信息查詢所述單克隆的HPPD基因序列并以此為模板設(shè)計(jì)引物擴(kuò) 增得到具有HPro抑制劑抗性的HPro基因片段并測序；
[0033]根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，將所述具有HPro抑制劑抗性的HPro基因的開放閱讀框序 列連入質(zhì)粒中并于細(xì)菌中進(jìn)行原核表達(dá)。
[0034] 16s rRNA普遍存在于所有細(xì)菌染色體基因中。rRNA參與生物蛋白質(zhì)的合成過程， 其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物進(jìn)化的漫長歷程中其基因序列較為保守，變 異較小，可看作為生物演變的時(shí)間鐘，其可變區(qū)序列因細(xì)菌不同而異，恒定區(qū)序列基本保 守，所以可利用恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，將16s rDNA片段擴(kuò)增出來，利用可變區(qū)序列的差異來 對不同菌屬、菌種的細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定。擴(kuò)增16